Proteins secreted by the type VII secretion system of Mycobacterium abscessus : their role in virulence and host response

Les mycobactéries possèdent des systèmes de sécrétion de type VII (SST7) aussi nommé ESX. Récemment, notre laboratoire a démontré que le système ESX-4 de M. abscessus est un acteur essentiel à sa survie intracellulaire. De plus, la mutation du gène codant pour une protéine structurale de l’ESX-4 entraîne une diminution de la sécrétion de plusieurs protéines dont deux appartenant au locus esx-4, EsxU et EsxT. Pour ce projet, nous avons étudié le rôle des protéines EsxU et EsxT chez M. abscessus. Nous avons d'abord démontré la localisation de ces protéines chez M. abscessus. EsxU et EsxT sont associées avec la membrane bactérienne et secrétées dans le milieu extérieur. De plus, elles forment un complexe caractéristique des protéines sécrétées par les SST7 des mycobactéries et sont capables in vitro d’interagir avec des membranes artificielles pour former des structures semblables à des pores. Dans les macrophages, leur absence n'influence pas le comportement intracellulaire de la souche mutée ΔesxUT, mais empêche la rupture de la membrane phagosomale, maintenant M. abscessus ΔesxUT dans un phagosome non acidifié. Enfin, nous identifions un phénotype hypervirulent associé à ΔesxUT, caractérisé par une augmentation de la mortalité et de la croissance bactérienne chez la souris et le poisson zèbre. L’ensemble de nos résultats suggèrent que l'absence des deux substrats améliore la survie et la persistance de M. abscessus dans ces modèles animaux. Nous avons aussi voulu étudier le potentiel immunogène de ces protéines. La réponse lymphocytaire T, vis-à-vis de peptides synthétiques des protéines EsxU et EsxT n’a pas permis d’identifier d’épitopes induisant une réponse T. Ceci suggère qu’EsxU et T ne sont pas immunogènes après inoculation de M. abscessus par voie sous-cutanée dans le modèle souris ce qui laisse penser qu’EsxU et EsxT ne représentent pas de bons marqueurs de l’infection. Le sécrétome ainsi qu’une analyse bio-inform atique basée sur la recherche de motifs de sécrétion ont permis d’identifier d’autres substrats potentiels de SST7 chez M. abscessus. Deux protéines avec un motif proline-glutamate (PE) et proline-glutamate-glutamate (PPE) ont des peptides qui induisent une réponse immunitaire Th1. Néanmoins des expériences supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si ces protéines représentent de bonnes cibles de diagnostic chez les patients et si elles sont capables de discriminer les infections à M. abscessus des infections causées par d’autres mycobactéries.Mycobacteria possess type VII secretion systems (T7SS), also known as ESX. Recently, our laboratory has demonstrated that the ESX-4 system of M. abscessus is an essential actor in the intracellular survival of M. abscessus Furthermore, mutation of the gene coding for a structural protein of ESX-4 leads to a decrease in the secretion of several proteins, two belonging to the esx-4 locus, EsxU and EsxT. For this project, we studied the role of EsxU and EsxT proteins in M. abscessus. We first demonstrated the localization of these proteins in M. abscessus, EsxU and EsxT are associated with the bacterial membrane and are also secreted. Furthermore, EsxU and EsxT form a complex characteristic of proteins secreted by mycobacterial T7SS. EsxU and EsxT proteins are able to interact with artificial membranes to form pore-like structures in vitro. In an intramacrophage context, esxU and esxT absence does not influence the intracellular behaviour of the ΔesxUT mutated strain, but prevents the disruption of the phagosomal membrane, keeping M. abscessus ΔesxUT in an unacidified phagosome. Finally, we identify a hypervirulent phenotype associated with ΔesxUT deletion characterized by increased animal mortality and bacterial growth in mice and zebrafish. All our results suggest that the absence of both substrates improves the survival and persistence of M. abscessus in animals. We also wanted to study the immunogenic potential of these proteins. The T cell response to synthetic peptides of the EsxU and EsxT proteins did not identify epitopes that induce a T response. This suggests that EsxU and T are not immunogenic after subcutaneous inoculation of M. abscessus in the mouse model suggesting that EsxU and EsxT are not good markers of infection. The secretome and a bioinformatics analysis based on the search for secretion patterns identified other potential substrates of SST7 in M. abscessus. Two proteins with a proline-glutamate (PE) an d proline-glutamate-glutamate (PPE) motif have peptides that induce a Th1-type immune response. However, further experiments are needed to determine whether these proteins represent good diagnostic targets in patients and whether they are able to discriminate M. abscessus infections from infections caused by other mycobacteria