Chronic pain : implication and therapeutic potential of the FXYD family members

Douleurs chroniques : Implication et potentiel thérapeutique des membres de la famille FXYDLes douleurs chroniques constituent un problème majeur de santé publique affectant près de 18% de la population mondiale. Elles ont des conséquences néfastes sur la qualité de vie des patients et engendrent des situations critiques sur le plan médical, sociologique et économique. Les traitements actuels sont relativement limités, souvent inefficaces et/ou présentent des effets secondaires délétères. De fait, une meilleure connaissance et une meilleure prise en charge de cette pathologie constituent des enjeux importants en recherche fondamentale et clinique.Dans ce contexte, mon projet de thèse a porté sur deux protéines, Fxyd2 et Fxyd7, qui appartiennent à la famille des protéines à motif FXYD qui contient 7 membres. Ces deux protéines sont décrites comme modulateurs de l’activité de la pompe Na,K-ATPase, et sont présentes dans des sous-types très spécifiques de neurones somatosensensoriels au sein des ganglions rachidiens dorsaux. La pompe Na,K-ATPase est décrite dans de nombreux phénomènes physiologiques et joue un rôle important dans l’excitabilité neuronale par le maintien du potentiel membranaire grâce à un jeu d'entrée et de sortie de sodium (Na+) et de potassium (K+). Le maintien de cet équilibre ionique est d’autant plus important que des phénomènes d’hyperexcitabilité neuronale sont souvent décrits dans le cadre des douleurs chroniques.Dans un premier objectif de mon projet de thèse, j’ai participé au développement d’une stratégie thérapeutique transposable à l’Homme basée sur une approche innovante de thérapie génique d’extinction. Ainsi, nous avons montré que l’usage d’oligonucléotides antisens lipidomodifiés dirigés contre le gène Fxyd2 et administrés par voie intrathécale permet un effet analgésique puissant chez des rats en condition de douleur neuropathique ou inflammatoire, aboutissant au retour à une sensibilité mécanique normale. De plus, des modifications chimiques conférant une meilleure stabilité de notre molécule thérapeutique permettent de prolonger son efficacité jusqu’à 10 jours.Mes travaux se sont portés, dans un deuxième objectif, sur la compréhension des modes d’action de Fxyd2 dans la physiopathologie des neurones somatosensoriels des ganglions rachidiens dorsaux notamment en identifiant ses partenaires protéiques par une approche protéomique. Ainsi, nous avons montré par spectrométrie de masse en tandem et par Proximity Ligation Assay, que Fxyd2 pouvait interagir de manière directe avec d’autres protéines que la sous unité ɑ1 de la pompe Na,K-ATPase en condition physiologique chez la souris. En effet, Fxyd2 semble interagir également avec la sous unité ɑ3 de cette pompe et aussi avec la PMCA, la GST et la Prdx6.Dans un troisième objectif, j’ai également étudié le rôle du gène Fxyd7 dans le système somatosensoriel aussi bien en condition normale que pathologique. Dans un premier temps, j’ai confirmé son profil d’expression au sein de sous populations neuronales de nocicepteurs peptidergiques, de mécanocepteurs et de neurones proprioceptifs dans les GRD de souris. Ensuite, en utilisant la souris Knock-Out pour le gène Fxyd7, j’ai procédé à des différents tests de motricité, d’équilibre et de sensibilité qui n’ont montré aucun défaut majeur chez ces souris en condition naïve. En condition de douleur neuropathique, avec le modèle SNL (Spinal Nerve Ligation), les tests de sensibilité mécanique ont montré aucune influence de la mutation, ni sur la phase aigüe de la douleur, ni sur sa chronicisation alors qu’en condition de douleur inflammatoire, avec le modèle CFA (Complete Freund’s Adjuvant), l’absence du gène empêche la chronicisation de la douleur inflammatoire de manière remarquable.Nos résultats montrent ainsi un potentiel thérapeutique majeur de deux membres de la famille FXYD pour traiter les douleurs chroniques.Chronic pain: Implication and therapeutic potential of FXYD protein members Chronic pain is a major public health problem affecting nearly 18% of the world’s population. It has deleterious consequences on patient’s quality of life and generates critical situations on the medical, sociological and economic levels. Current treatments are relatively limited, often ineffective and/or have deleterious side effects. In fact, better knowledge and an improved management of these pathologies is a major challenge for fundamental and clinical research.In this context, my thesis project is based on two different proteins, Fxyd2 and Fxyd7, which are members of a family of 7 proteins which contain a characteristic FXYD amino-acid motif. These two proteins have been described as modulators of the Na,K-ATPases’ activity, and are present in very specific somatosensory neurons of the dorsal root ganglia. The Na,K-ATPase pump is implicated in a large variety of physiological phenomena with a critical role in neuronal excitability by maintaining membrane potential thanks to the transfer of sodium (Na+) and potassium (K+). The maintenance of this ionic equilibrium is a crucial point since neuronal hyperexcitability has often been described in chronic pain.The first objective of my thesis was to develop a therapeutic strategy suitable for human therapy based on a very innovative gene extinction strategy. Thus, we showed that lipidomodified antisense oligonucleotides directed against the Fxyd2 gene and administered intrathecally induce a strong analgesic effect in neuropathic pain or in inflammatory pain models of rats, leading to normal mechanical sensitivity. Moreover, we showed that specific chemical modifications induce a better stability of our therapeutic molecule which prolongs its efficacy up to 10 days.In the second objective, my work was directed toward understanding the mechanisms of action of Fxyd2 in neuronal physiopathology in dorsal root ganglia, especially by identifying its protein partners using a proteomic approach. Thus, I showed by tandem mass spectrometry and by Proximity Ligation Assay that Fxyd2 could interact directly with proteins other than the ɑ1 subunit of the Na,K-ATPase in physiological conditions in mice. Indeed, Fxyd2 seems to interact also with the ɑ3 subunit of this pump and also with PMCA, GST and Prdx6.My third objective was to study the role of the Fxyd7 gene in the somatosensory system in normal and pathological conditions. In the first place, I used in situ hybridization to show its expression in specific neuronal subpopulations including peptidergic nociceptors, mechanoreceptors and in proprioceptive neurons in the mouse DRG. Then, using motor, equilibrium and mechanical sensitivity tests in Fxyd7 KO mice, I demonstrated the absence of major behavioral defects in these mice in normal conditions. In neuropathic pain conditions, using the SNL (Spinal Nerve Ligation) model, mechanical sensitivity tests did not reveal any influence of this mutation, neither in the acute nor chronic phases. However, in chronic inflammatory pain conditions induced by injection of CFA (Complete Freund’s Adjuvant), Fxyd7 null mutants failed to maintain pain responses. Thus Fxyd7 expression in DRG neurons appears to be specifically required for the maintenance of chronic inflammatory pain.Our results thus show a major therapeutic potential of two FXYD family members to treat chronic pain