Initial molecular steps of bone regeneration : cellular scale modulation

Les facteurs morphogénétiques osseux (BMPs) sont des facteurs de croissance ayant plusieurs rôles physiologiques et pathologiques. Comme leur nom l'indique, ils sont ostéoinducteurs car ils favorisent la différenciation des cellules souches en ostéoblastes. En outre, ils sont impliqués dans un large éventail de processus physiologiques et pathologiques, notamment l'angiogenèse, l'adipogenèse, la différenciation musculaire, le développement embryonnaire et les cancers. In vivo, les BMPs se lient à deux types de récepteurs BMP (BMPR) ; type -I et type-II. Dans cette thèse, nous nous sommes concentrés sur les premières étapes de la formation du tissu osseux en commençant à l'échelle moléculaire par l'interaction BMP/BMPR. Le grand nombre de BMPs associé à un faible nombre de BMPRs conduit à un phénomène de promiscuité, où une protéine de BMP peut se lier à différents BMPRs avec des affinités diverses. Dans cette thèse, les affinités de liaison et les propriétés cinétiques de quatre BMPs : BMP-2, BMP-4, BMP-7 et BMP-9 avec cinq BMPRs de type I (ALK1, ALK2, ALK3, ALK5, ALK6) et trois BMPRs de type II (BMPR-II, ACTR-IIA, ACTR-IIB) ont d'abord été étudiées en utilisant l'interférométrie de biocouches (BLI) et la résonance plasmonique de surface (SPR). Dans une deuxième partie, des biomatériaux sous forme de films biomimétiques de polyélectrolytes ont été utilisés pour présenter la BMP aux cellules d'une manière liée à la matrice, et pour étudier l'effet combiné de la rigidité du film et de la présentation de la BMP-2 (pour la BMP-2, la BMP-4, la BMP-7 et la BMP-9). Les cellules myoblastes squelettiques C2C12 et les cellules souches dérivées du périoste humain (hPDSC) ont été utilisées comme modèles cellulaires de cellules sensibles aux BMPs. Un criblage à haut contenu (HCS) des réponses cellulaires a été effectué pour quantifier l'adhésion cellulaire évaluée par le nombre de cellules et la zone d'étalement cellulaire, ainsi que la différenciation cellulaire dans l'os en quantifiant les activités Smad et phosphatase alcaline (ALP). L'utilisation de la technique ARN silencing des récepteurs BMP et des récepteurs d'adhésion intégrines a permis de révéler les rôles spécifiques de chaque récepteur. Dans une troisième partie, un test HCS pour quantifier le Smad phosphorylé a été développé et une preuve de concept de tests de médicaments sur des biomatériaux a été réalisée, en utilisant des inhibiteurs commerciaux contre des récepteurs aux BMPs.Bone morphogenetic factors (BMPs) are growth factors with several physiological and pathological roles. As their name suggest, they are osteoinductive as they promote stem cells differentiation into osteoblasts, in addition, they are involved in a large panel of physiological and pathological processes, including angiogenesis, adipogenesis, muscle differentiation and embryonic development and cancers. In vivo, BMPs bind two types of BMP receptors (BMPR); type –I and type-II. In this thesis, we focused on the early steps of bone tissue formation starting at the molecular scale with the BMP/BMPR interaction. The large number of BMPs associated to a low number of BMPR leads to a phenomenon of promiscuity, where a BMP can bind different BMPRs with various affinities. In the thesis, The binding affinities and kinetic properties of four BMPs: BMP-2, BMP-4, BMP-7 and BMP-9 with five type-I BMPR (ALK1, ALK2, ALK3, ALK5, ALK6) and three type-II BMPRs (BMPR-II, ACTR-IIA, ACTR-IIB) were first studied using biolayer interferometry (BLI) and surface plasmon resonance (SPR). In a second part, biomaterials in the form of polyelectrolytes biomimetic films were used to present BMP to cells in a matrix-bound manner, and to study the combined effect of film stiffness and BMP-2 presentation ( for BMP-2, BMP-4, BMP-7 and BMP-9). C2C12 skeletal myoblasts and human periosteum-derived stem cells (hPDSCs) were used as cellular models of BMP-responsive cells. High content screening (HCS) of cellular responses was done to quantify cell adhesion evaluated by cell number and cell spreading area, and cell differentiation in bone by quantifying Smad and alkaline phosphatase (ALP) activities. Using RNA silencing of BMP receptors and of the adhesion receptors integrins enabled to reveal the specific roles of each receptors. In a third part, a HCS assay to quantify phosphorylated Smad was developed and a proof-of-concept of drug assays on biomaterials was realized, using commercial inhibitors against BMP receptors