Study of 3D cellular microenvironments for the development of bone marrow in-vitro models

L'étude du microenvironnement cellulaire a été une force motrice pour les scientifiques interdisciplinaires au cours de la dernière décennie, afin de fournir aux biologistes des modèles in vitro plus avancés et plus adaptés. Ces modèles cherchent à combler l'écart entre la culture cellulaire monocouche standard et les expériences in vivo avec des conditions de culture 3D standardisées. L'une des principales limites des modèles monocouches est l'imprécision inhérente à la reproduction de la complexité des tissus vivants. Les propriétés structurelles et mécaniques du tissu, l'impact sur l'adhésion des cellules, ou même le mouvement du liquide dans le tissu sont des caractéristiques clés souvent négligées, mais néanmoins pertinentes pour comprendre le comportement cellulaire. Dans les os, la porosité a un impact sur les propriétés mécaniques des structures osseuses et fournit une niche, qui est essentielle pour l'angiogenèse et pour la prolifération et la différenciation des cellules stromales mésenchymateuses (MSc) pendant les processus de réparation des os. Dans ce travail, nous cherchons à étudier des facteurs clés spécifiques du microenvironnement cellulaire de la moelle osseuse et à fournir de nouveaux outils pour reproduire les trois compartiments biologiques dans lesquels la moelle osseuse est divisée dans un seul modèle : endostéal (tissu osseux), périvasculaire (tissu endothélial) et niche centrale.Dans cette thèse, nous présentons deux approches différentes pour structurer des matériaux en 3D et générer la complexité architecturale nécessaire au développement de structures biologiques en 3D dans les cavités d'un échafaudage poreux. La première technique, centrée sur la fabrication additive, permet un contrôle précis de la topographie et cherche à dévoiler les limites des communications de contact cellulaire en produisant des squelettes à porosité ou taille de pores incrémentales. La seconde technique est une nouvelle structuration à forme libre basée sur la réticulation contrôlée d'une émulsion à haute phase interne (HIPE) à une température supérieure au point d'ébullition de la phase interne, l'eau. Ceci génère une expansion contrôlée de la vapeur de l'émulsion et la génération d'une gamme différente de porosité. La structure poreuse qui en résulte donne un dispositif polyvalent qui peut être coupé et déformé pour accéder à différentes informations. La combinaison des deux méthodes nous donne une vue plus large du microenvironnement cellulaire de la moelle osseuse.Dans le premier chapitre de cette thèse, nous présentons un examen complet des indices biophysiques du microenvironnement cellulaire et de l'état actuel des systèmes microphysiologiques de la moelle osseuse. Le chapitre 2 est centré sur la technique de structuration 3D et sur le développement technologique réalisé dans ce travail par les deux techniques. Le chapitre 3 traite de la validation biologique des structures en utilisant une lignée cellulaire, SaOS-2, avec des capacités d'adhésion similaires des cellules osseuses, et des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) primaires de la moelle osseuse humaine. Le chapitre 4 présente l'intégration et la caractérisation des deux techniques dans des systèmes perfusables, afin de fournir un flux de liquide au sein du microenvironnement cellulaire. Enfin, le chapitre 5 résume nos résultats et donne un aperçu des travaux actuels et de la perspective de ce projet en cours.The study of cellular microenvironment has been a driven force for interdisciplinary scientists in the last decade, to provide more advanced and suitable in-vitro models to biologists. Those models look to fill the gap between standard monolayer cell culture and in-vivo experiments with standardized 3D culture conditions. One of the main limitations of monolayer models is the inherent inaccuracy to reproduce the complexity of living tissue. Structural and mechanical properties of the tissue, impacting cell adhesion, or even the liquid movement within the tissue are key features frequently overlook yet relevant to understand the cellular behavior. In bones, porosity impacts the mechanical properties of the bone structures and provides a niche, which is essential for angiogenesis and for mesenchymal stromal cells (MSc) proliferation and differentiation during bone repairing processes. In this work, we pursue to study specific key factors of the cellular microenvironment of the bone marrow and provide new tools to reproduce the three biological compartments in which the bone marrow is divided within one single model: endosteal (bone tissue), perivascular (endothelial tissue) and central niche.In this thesis, we present two different approaches to structure 3D materials and generate the architectural complexity required for the development of 3D biological structures within the cavities of a porous scaffold. The first technique, centered around additive manufacturing, provides an accurate control of the topography and look to unveil the limits of the cell contact communications by producing scaffolds with incremental porosity or pore size. The second technique is a novel free-form structuration based on the controlled reticulation of a High Internal Phase Emulsion (HIPE) at a temperature over the boiling point of the internal phase, water. This generates a controlled expansion of the steam of the emulsion and the generation of a different range of porosity. The resulted porous structure results in a versatile device that can be cut and deformed to access different information. The combination of both methods gives us a larger view of the cellular microenvironment of the bone marrow.In the first chapter of this thesis, we present a comprehensive review of the biophysical cues of the cellular microenvironment and the current state of the bone marrow microphysiological systems. Chapter 2 is centered around the 3D structuration technique and the technological development achieved in this work by both techniques. Chapter 3 discusses the biological validation of the structures using a cell line, SaOS-2, with similar adhesion capabilities of bone cells, and primary human bone marrow mesenchymal stromal cells (MSCs). Chapter 4 presents the integration and characterization of both techniques in perfusable systems, in order to provide liquid flow within the cellular microenvironment. Finally, chapter 5 summarizes our results and provides an overview of the current work and perspective of this ongoing project