Mécanisme de stabilisation et motilité des blebs dans les cellules cancéreuses

Auparavant associées à l'apoptose, les blebs sont apparus au cours de la dernière décennie en tant que structures importantes pour la migration des cellules amiboïdes, en particulier pour les cellules cancéreuses. Des blebs se forment lorsque la membrane plasmique se détache du cortex d'actomyosine. Ils se rétractent en exerçant des forces de friction et en permettant aux cellules de migrer. Ces dernières années, quelques études indépendantes ont observé des blebs volumineux et stables dans des cellules sous confinement non adhésif. Ce changement universel vers la migration à base de blebs a été observé dans les amibes, les choanoflagellés, les lignées cellulaires immortalisées et les cultures primaires. Contrairement aux blebs précédemment décrits, ils sont capables de surmonter la rétraction et de maintenir un flux d'actomyosine constant. Les blebs stables forment un nouveau type de structures cellulaires que les cellules amiboïdes utilisent pour migrer, analogues aux filopodes ou lamellipodes pour les cellules mésenchymateuses. Dans une seule cellule, plusieurs blebs se forment et se font concurrence, de telle sorte que finalement un seul bleb entraîne la migration. Ainsi, il est important de savoir comment les blebs simples sont stabilisés pour comprendre comment les cellules amiboïdes se polarisent. Plus généralement, des flux d'actomyosine stables constituent la base d'une migration rapide dans de nombreux types de cellules, y compris également des cellules immunitaires. Pendant mon doctorat, j'ai étudié la morphogenèse et la stabilisation des blebs dans les cellules cancéreuses confinées, en utilisant des techniques microfluidiques avancées pour contrôler le confinement des cellules. La première partie de mon projet décrit la formation de blebs comme une réponse immédiate des cellules au confinement et ce qui les différencie des blebs rétractables classiques. La deuxième partie de mon projet se concentre sur le mécanisme conduisant à l'établissement d'un flux rétrograde. Sur la base des résultats que j'ai obtenus avec mes expériences, nous proposons que la stabilisation du bleb dépend de 1) l'épuisement de l'actine par la contractilité de la myosine et 2) la disposition particulière des filaments d'actine à l'extrémité du bleb causée par la topologie de la membrane. J'ai complété ce travail avec une imagerie avancée qui a permis l'observation de filaments d'actine uniques et des molécules associées au cytosquelette au bout du bleb, sous différentes perturbations. Cet ensemble unique d'observations a permis de compléter un modèle pour la stabilisation des blebs motiles, avec des conclusions qui peuvent être généralement appliquées à tout flux de cortex d'actomyosine. Mes résultats montrent trois régimes de cortex dans les blebs : 1) Assemblage de cortex lâche : localisé à l'extrémité, composé de filaments simples mal fixés à la membrane. Si cette région est perdue, le bleb se rétracte. 2) Cortex réticulé : les filaments et les fibres d'actine se lient pour former un réseau qui se densifie et se réticule progressivement mais ne se contracte pas (cette région est dépourvue de moteurs Myosine-II). 3) Cortex contractile : vers la base du bleb. La Myosine-II commence à s'enrichir en contractant le réseau dense d'actine, entraînant tout le flux d'actine rétrograde jusqu'à l'extrémité du bleb, générant de nouvelles régions sans actine à l'extrémité et comprimant le bleb, conduisant à une avancée de la membrane à l'avant.Previously associated with apoptosis, blebs have arisen in the past decade as important structures for amoeboid cell migration, particularly for cancer cells. Blebs are formed when the plasma membrane detaches from the actomyosin cortex. They retract exerting friction forces and allowing cells to migrate. In recent years, a few independent studies have reported large and stable blebs in cells under non-adhesive confinement. This universal switch to bleb-based migration has been found in amoeba, choanoflagellates, immortalized cell lines and primary cultures. Unlike previous blebs described, they are able to overcome retraction and stabilize a constant flow. Stable blebs are a new type of cellular structures that amoeboid cells use to migrate, analogous to filopodia or lamellipodia for mesenchymal cells. In a single cell, multiple blebs form and compete against each other, so that eventually a single bleb drives the migration. Thus, it is important to know how single blebs are stabilized to understand how single-bleb amoeboid cells polarize. More generally, stable actomyosin flows constitute the basis of fast migration in numerous cell types, including also immune cells. During my Ph.D. I studied bleb morphogenesis and bleb stabilization in confined cancer cells, using advanced microfluidic techniques to control the confinement of cells. The first part of my project describes the blebs forming as an immediate response of cells to confinement and what differentiates it from a classical retracting bleb. The second part of my project focuses on the mechanism leading to the establishment of a retrograde flow. Based on the results I obtained with my experiments, we propose that bleb stabilization depends on 1) the depletion of actin by myosin contractility and 2) the particular actin filament arrangement at the bleb tip caused by the membrane topology of a confined cell. I completed this work with advanced imaging which allowed observation of single actin filaments and tagged cytoskeleton-associated molecules at the bleb tip, under different perturbations. This unique set of observations allowed to complete a model for the stabilization of motile blebs, with conclusions that can be generally applied to any flowing actomyosin cortex. My results show three cortex regimes in blebs: 1) Assembling loose cortex: localized at the tip, composed of single filaments poorly attached to the membrane. If this region is lost, the bleb retracts. 2) Crosslinked cortex: actin filaments and fibers bind together to form a network which gradually gets denser and reticulated but do not contract (this region is devoid of Myosin II motors). 3) Contractile cortex: towards the base of the bleb. Myosin-II starts to get enriched contracting the dense actin network, driving the entire retrograde actin flow up to the tip of the bleb, generating new actin free regions at the tip and pressurizing the bleb, leading to membrane protrusion at the very front