Role of ubiquitin-like protéines in the cross-talk between the Ubiquitin Proteasome System and Autophagy in Mantle Cell Lymphoma

Le protéasome est à l’origine de la dégradation de protéines essentielles à certains évènements cellulaires importants, dont certains régulent la progression tumorale. L’activité du protéasome peut être contrôlée par de petites molécules inhibitrices comme le Bortezomib (BTZ), couramment utilisé en chimiothérapie. Le BTZ entraîne l’accumulation de nombreux facteurs intracellulaires, potentiellement impliqués dans la réponse ou même dans la résistance à ce traitement. En conséquence, étudier la réponse cellulaire aux inhibiteurs de protéasome, notamment le rôle des modifications post-traductionnelles associées au système ubiquitin-protéasome, pourrait permettre la compréhension de la résistance des cancers au BTZ.Dans cette perspective, les expériences de ce projet de thèse ont été réalisées sur le modèle du lymphome du manteau. Depuis l’approbation par l’Agence américaine des produits alimentaires et médicamenteux du BTZ pour le traitement de ce cancer, de nombreux travaux explorent les mécanismes probables de résistance au BTZ observés dans plus de la moitié des patients traités. Cependant, les caractéristiques moléculaires de ce phénotype ne sont pas totalement élucidées. Plusieurs lignées cellulaires du lymphome du manteau, sensibles ou résistantes au BTZ, ont été utilisées dans ces travaux pour étudier les mécanismes qui jouent un rôle dans l’adaptation cellulaire aux inhibiteurs de protéasome.Une analyze protéomique comparative entre des cellules du lymphome du manteau, sensibles et résistantes au BTZ, a révélé un enrichissement du système autophagie-lysosome concomitant avec une réduction des sous unités du protéasome dans le protéome ubiquitin des cellules résistantes au BTZ. Nous avons démontré que ces phénotypes sont associés à l’activation d’une protéaphagie dans plusieurs modèles cellulaires du lymphome de manteau possédant une résistance au BTZ innée et acquise. Ainsi, la Bafilomycin-A1 et la choroquine, tous deux inhibiteurs d’autophagie, entraînent l’accumulation des sous unités du protéasome avec les protéines LC3B et p62, marqueurs de l’autophagie. Le récepteur d’autophagie p62 est central pour la protéaphagie, son action a donc été inhibée par la Verteporfin (VTP). Nous avons montré que ce composé aggrège p62 et bloque la protéaphagie en réduisant les interactions de p62 avec le protéasome. De plus, la VTP entraîne la dissociation des complexes protéasomales 30S et 26S. Cela induit de forts effets cytotoxiques et explique, au moins en partie, la résistance au BTZ dans les cellules du lymphome de manteau. Ces données peuvent participer à l’amélioration de l’utilisation clinique du BTZ chez le patient. Afin d’étudier plus en détails la régulation d’évènements d’autophagie sélective comme la protéaphagy, les outils et les méthodes disponibles sont limités. On connaît très peu les rôles précis de certains régulateurs clés de l’autophagie, comme les protéines de la famille ATG8, aussi appelés LC3/GABARAP chez les mammifères. Pour cette raison, des nouveaux pièges moléculaires ont été développés dans ce projet pour isoler et étudier ces protéines ATG8 et leurs interactions. Ces nouveaux outils ont été construits à partir de l’affinité naturelle que les Régions d’Interactions avec les LC3 ont pour les protéines ATG8. Trois systèmes de capture distincts appelés pièges à LC3 ont été caractérisés avec une grande affinité de l’ordre du nanomolaire pour les protéines LC3/GABARAP. Les pièges à LC3 sont capables d’extraire les protéines LC3 ou GABARAP endogènes des cellules mammifères. De plus, ces outils sont capables de différencier les protéines LGG1 et LGG2 de C. Elegans, suggérant qu’ils puissent capturer les protéines ATG8 dans d’autres organismes. Avec toutes ces propriétés, les pièges LC3 sont des outils multi-fonctions qui sont en capacité d’être utilisés pour un large panel d’applications, améliorant ainsi l’étude des évènements d’autophagie sélective dans de multiples modèles biologiques.The proteasome is responsible for the degradation of proteins involved in essential cellular events including those regulating tumor progression. The activity of the proteasome could be modulated by small molecules inhibitors such as Bortezomib (BTZ), currently used in therapy. BTZ promotes the accumulation of many intracellular factors, potentially implicated in the response or resistance to this drug. Thus, investigating the response to proteasome inhibitors and the role of the post-translational modifications associated to the ubiquitin-proteasome system (UPS) could help to understand BTZ-resistance in cancer. To address this question, most experiments of this thesis were performed in mantle cell lymphoma (MCL) cell models. Since BTZ approval by the FDA (Food and Drug Administration) in 2006 for treatment of this cancer, numerous publications explore the possible mechanisms of BTZ resistance observed in patients. However, the molecular basis of this phenotype remain to be fully investigated. Various MCL cell lines showing sensitivity or resistance to BTZ were used in this project to investigate the mechanisms involved in the cellular adaptation to proteasome inhibitors. A comparative proteomic analysis of BTZ-resistant and BTZ-sensitive MCL cells revealed an enrichment of components of the Autophagy lysosome System (AS) and a reduction of proteasome subunits in the ubiquitin proteome isolated from BTZ-resistant cells. We demonstrated that this feature was associated with the constitutive activation of proteaphagy in distinct MCL cell models with acquired and inherent BTZ resistance. Consistently, the autophagy inhibitors Bafilomycin-A1 and Chloroquine increased levels of proteasome subunits along with autophagy markers such as LC3B and p62. Since the autophagy receptor p62 drives proteaphagy, its action was inhibited using Verteporfin (VTP). We showed that this drug aggregated p62 and inhibited proteaphagy by reducing p62 interaction with proteasome subunits. Furthermore, VTP treatment induced the dissociation of 30S and 26S proteasome complexes. This resulted in high cytotoxic effects in BTZ-resistant MCL cells and in in vivo xenografted mouse models. Thus, proteaphagy is a mechanism that could explain, at least in part, the resistance to BTZ of MCL cells. Our data open possible routes to improve BTZ clinical use in patients.To further investigate the regulation of selective autophagy events such as proteaphagy, tools and methods available are limited. Little is known about the roles of ATG8s family proteins also called LC3/GABARAPs in mammalians that are key regulators of autophagy. For this reason, novel molecular traps were developed here to isolate and study LC3/GABARAPs proteins and their interactors. These tools were based on the natural affinities of the LC3 Interacting Regions (LIR) for LC3/GABARAPs proteins. Three capturing systems called LC3-traps have been characterized with specificities for distinct LC3/GABARAP proteins. They display an affinity equivalent to the one of a good antibody, in the low nano-molar range. LC3-traps were able to pull down endogenous LC3s or GABARAPs proteins from mammalian cells. Furthermore, these LC3-traps differentiated LGG1 and LGG2 in C. Elegans, suggesting that most likely these tools would be able to capture ATG8 proteins from other model organisms. Giving all these characteristics, LC3-traps are versatile tools that can potentially be used for a large panel of applications improving the monitoring of selective autophagy pathways in multiple physiological and pathological event