Multi-omics study on the effects of anthocyanin extracts from bilberries and purple potatoes on type 2 diabetes in Zucker diabetic fatty rats

Anthocyanins are a group of flavonoids in purple and red berries, fruits, and tubers. Anthocyanins have been widely reported to have antidiabetic effects, which may arise from the modulation of carbohydrate and lipid metabolism and gut microbiota as well as from antioxidative and inflammatory effects. Anthocyanins can be divided into acylated anthocyanins and nonacylated anthocyanins according to the presence of an acyl group on the sugar residue of the aglycone. Acylation of anthocyanins increases the structural stability of the molecules, which affects their physico-chemical properties, such as a greater capacity to inhibit lipid peroxidation, antioxidant activity, and resistance to digestion compared with their nonacylated counterparts. Previous research has largely focused on the bioactivities of nonacylated anthocyanins from berries and other colored fruits, while the biological effects of acylated anthocyanins have received very little attention in research. This thesis work investigated the effects of nonacylated anthocyanin extract from bilberries and acylated anthocyanin extract from purple potatoes on the plasma, hepatic, and gut luminal metabolites as well as hepatic transcriptome and gut microbiota in a type 2 diabetes (T2D) model. Zucker diabetic fatty (ZDF) rats were used as an animal model of T2D and fed with anthocyanin extracts for 8 weeks at daily doses of 25 or 50 mg/kg body weight. The lean Zucker rats were used as the healthy control model. Anthocyanin composition in two extracts was measured by high-performance liquid chromatograph and mass spectroscopy. 1H NMR metabolomics, full-length RNA sequencing, and metagenomics were used to study metabolites, transcriptome, and gut microbiota affected by T2D and anthocyanin extracts. The anthocyanins extracted from bilberries were all nonacylated and consisted of mostly glucosides, galactosides, and arabinosides of delphinidin, petunidin, cyanidin, peonidin, and malvidin. The anthocyanins extracted from purple potatoes were mainly acylated and dominated by petunidin coumaroylrutinoside- glucoside, peonidin coumaroyl-rutinoside-glucoside, and petunidin caffeoyl-rutinoside-glucoside. The indicators of feed and water intake, the body weight and ratio of viscera to body weight as well as plasma and hepatic glucose manifested the T2D in ZDF rats. Dysregulated energy metabolism including increased glycolysis influxes and substrates of gluconeogenesis, insulin resistance biomarkers, and lipids were found in T2D of ZDF rats. Defects in gut microbiota also characterized the ZDF rats. Both anthocyanin extracts reduced the levels of fasting plasma and hepatic glucose and branched-chain amino acids (BCAAs), hepatic intermediates of glycolysis and gluconeogenesis as well as regulated plasma lipid profile. However, only the treatment with acylated anthocyanin extract reversed the changes in the intermediates of glycolysis and gluconeogenesis at systemic level and regulated hepatic lipids. At the gene level, nonacylated anthocyanin extract reversed the expression of Mgat4a, Gstm6, and Lpl, whereas acylated anthocyanin extract reversed the expression of Mgat4a, Jun, Fos, and Egr1 in the diabetic status. Acylated anthocyanin extract also affected activator protein 1 and interleukin 1 production based on gene set enrichment analysis. For the gut luminal metabolites, both types of anthocyanin extract increased sugars level in cecal content and affected choline metabolism. Acylated anthocyanin extract increased cecal short-chain fatty acids and decreased fecal lactate. Anthocyanin extracts also beneficially modulated gut microbiota composition. Both types of anthocyanin extracts increased the abundance of Peptostreptococcaceae sp. and Marvinbryantia formatexigenes. Acylated anthocyanin extract decreased the abundances of Parabacteroides disdasonis, Ruminococcus torques, and Lanchnospiraceae bacterium 4_1_37FAA. This thesis work comprehensively compared the effects of two different types of anthocyanin extracts from different sources on the diabetic state. Different beneficial effects were seen, with the acylated anthocyanin extract from purple potatoes showing more beneficial effects. More importantly, purple potatoes could be considered as a complement or substitute for berries as a source of dietary anthocyanins. Since potatoes are a sustainable staple food, the demand for anthocyanin-rich purple potatoes with a health-promoting effect is likely to increase. Enhanced stability and stronger modulatory effects of acylated anthocyanins may create new opportunities for its use in food applications.Antosyaanit ovat sinipunaisissa ja punaisissa marjoissa, hedelmissä ja mukuloissa esiintyviä flavonoideja. Antosyaaneilla on havaittu olevan diabetesta ehkäiseviä ominaisuuksia, jotka saattavat liittyä hiilihydraatti- ja rasvaaineenvaihdunnan ja suolistomikrobiston säätelyyn sekä antioksidatiivisiin ja anti-inflammatorisiin ominaisuuksiin. Antosyaanit voidaan luokitella asyloituihin tai asyloimattomiin antosyaaneihin riippuen siitä, onko aglykonin sokeriosaan kiinnittynyt asyyliryhmä. Antosyaanien asylointi stabiloi molekyylin rakennetta, mikä vaikuttaa yhdisteen fysikaalis-kemiallisiin ominaisuuksiin parantaen esimerkiksi kykyä estää rasvojen peroksidaatiota, antioksidatiivisuutta ja vastusta ruuansulatukselle verrattuna asyloimattomiin antosyaaneihin. Aiemmat tutkimukset ovat pääosin keskittyneet marjojen ja hedelmien asyloimattomien antosyaanien bioaktiivisuuteen, kun taas asyloitujen antosyaanien biologiset vaikutukset ovat jääneet vähälle huomiolle. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin mustikan asyloimattomien ja violetin perunan asyloitujen antosyaanien vaikutuksia plasman, maksan ja suoliston ontelon aineenvaihduntatuotteisiin, maksan transkriptomiin sekä suolistomikrobistoon tyypin 2 diabetes (T2D) -eläinmallissa. Mallina käytettiin diabeettisia, lihavia Zucker-rottia (ZDF), joille syötettiin antosyaaniuutetta kahdeksan viikon ajan päivittäisellä annoksella 25 tai 50 mg/painokilo. Terveenä kontrollina käytettiin laihoja Zucker-rottia. Uutteiden antosyaanikoostumukset määritettiin korkean erotuskyvyn nestekromatografian ja massaspektrometrian avulla. T2D:n ja antosyaaniuutteiden vaikutusta aineenvaihduntatuotteisiin, transkriptomiin ja suoliston mikrobiotaan tutkittiin 1H NMR -metabolomiikan, täyspitkän RNA:n sekvensoinnin sekä metagenomiikan avulla. Kaikki mustikasta eristetyt antosyaanit olivat asyloimattomia ja koostuivat lähinnä delfinidiinin, petunidiinin, syanidiinin, peonidiinin ja malvidiinin glukosideista, galaktosideista ja arabinosideista. Violetista perunasta eristetyt antosyaanit olivat pääosin asyloituja, joista runsaimpia olivat petunidiini- (kumaroyylirutinosidi)-glukosidi, peonidiini-(kumaroyylirutinosidi)-glukosidi, petunidiini-(kafeyylirutinosidi)-glukosidi. ZDF-rottien rehun ja vedenkulutus, paino, painon ja sisäelinten suhde sekä plasman ja maksan glukoosiarvojen suhde ilmensivät diabetestilaa. ZDF-rottien energia-aineenvaihdunta oli häiriintynyt T2D-tilassa, mikä ilmeni lisääntyneenä glykolyysin virtauksena sekä glukoneogeneesin substraattien, insuliiniresistenssin biomarkkereiden ja lipidien määränä. ZDF-rotilla ilmeni myös suoliston mikrobiotan häiriöitä. Molemmat antosyaaniuutteet alensivat paastoplasman ja maksan glukoosin ja haaroittuneiden aminohappojen pitoisuutta ja maksan glykolyyttisiä ja glukoneogeneettisia välituotteita, ja säätelivät plasman lipidiprofiilia. Kuitenkin vain asyloituja antosyaaneja sisältävä uute vähensi glykolyysin ja glukoneogeneesin välituotteiden muutoksia systeemitasolla ja sääteli maksan lipidejä. Geenitasolla asyloimattomia antosyaaneja sisältävä uute vaikutti geenien Mgat4a:n, Gstm6:n ja Lpl:n ekspressioon diabeettisilla rotilla, kun taas asyloituja antosyaaneja sisältävä uute vaikutti Mgat4a:n, Jun:n, Fos:n ja Egr1:n ekspressioon. Geenisarjojen rikastamisanalyysin perusteella asyloituja antosyaaneja sisältävällä uutteella oli vaikutus myös aktivaattoriproteiini 1:n ja interleukiini 1:n tuotantoon. Molemmat uutteet lisäsivät paksusuolen alkuosan sokeripitoisuuksia ja vaikuttivat koliiniaineenvaihduntaan suolessa. Asyloituja antosyaaneja sisältävä uute lisäsi lyhytketjuisten rasvahappojen määrää paksusuolen alkuosassa ja vähensi laktaatin määrää ulosteessa. Antosyaaniuutteilla oli myönteinen vaikutus suoliston mikrobiotan koostumukselle. Molemmat uutteet lisäsivät Peptostreptococcaceae sp.:n ja Marvinbryantia formatexigenesin abundanssia. Asyloitu antosyaani -uute vähensi Parabacteroides disdasonisin, Ruminococcus torquesin ja Lanchnospiraceae bacterium 4_1_37FAA:n abundanssia. Tämä väitöskirjatyö vertasi kokonaisvaltaisesti kahden erilaisen antosyaaniuutteen vaikutuksia diabeteksessa. Uutteiden vaikutukset erosivat toisistaan, mutta asyloituja antosyaaneja sisältävällä, violetista perunasta eristetyllä uutteella havaittiin enemmän hyödyllisiä vaikutuksia. Violetteja perunoita voitaisiin käyttää antosyaanien lähteenä ravinnossa marjojen ohella tai sijasta. Koska peruna on kestävä peruselintarvike, terveyttä edistäviä antosyaaneja sisältävien perunoiden kysyntä saattaa lisääntyä. Stabiilit antosyaanimolekyylit ja niiden ravitsemusvaikutukset saattavat myös edistää niiden hyödyntämistä erilaisissa elintarvikesovelluksissa