Testiranje gena kandidata uključenih u biosintezu metabolita biljke Arnica montana

Arnica montana L. is a traditional medicinal plant used for centuries. It owes its medicinal properties to sesquiterpene lactones, helenalin and dihydrohelenalin. Traditionally, the plants are harvested from its natural habitat, but there is need for alternative ways to sustainably obtain bioactive compounds. To achieve alternative production of A. montana bioactive sesquiterpene lactones, their biosynthesis pathway must be elucidated. Functional characterization of candidate genes, that might be involved in sesquiterpene lactones biosynthesis, has been conducted in the heterologous expression system yeast Saccharomyces cerevisiae and compounds analysis via gas chromatography-mass spectrometry. Additionally, analysis of potential candidate genes expression patterns and sesquiterpene lactones content distribution in plants was carried out. Candidate genes AmGAS and AmGAO were verified to encode respective germacrene A synthase and germacrene A acid oxidase, and their enzymatic activity was confirmed. Candidate genes AmCYPs were functionally analysed to a certain extent, with candidate AmCYP7 showing great potential for further investigation. Correlation of expression patterns and content of bioactive compounds in A. montana tissues revealed that among tested, AmCYP7 gene has potential to be part of sesquiterpene lactones biosynthesis pathway and provided preliminary evidence for their biosynthesis at different developmental stages during the plant´s life cycle.Arnica montana L. je biljka koja se stoljećima koristi u tradicionalnoj medicini. Za njezina ljekovita svojstva odgovorni su seskviterpenski laktoni, helenalin i dihidrohelenalin. Arnika se tradicionalno ubire s prirodnog staništa i postoji potreba za alternativnim i održivijim načinima sinteze bioaktivnih sastojaka. Kako bi alternativna proizvodnja bioaktivnih seskviterpenskih laktona bila moguća, potrebno je razjasniti put biosinteze. Provedena je funkcionalna karakterizacija gena kandidata iz A. montana, koji su potencijalno uključeni u biosintetski put seskviterpenskih laktona, u heterolognom ekspresijskom sustavu, kvascu Saccharomyces cerevisiae. Metaboliti sintetizirani u kvascu analizirani su plinskom kromatografijom i masenom spektrometrijom. Također, analizirani su ekspresijski obrasci gena kandidata te distribucija i sadržaj seskviterpenskih laktona u različitim tkivima biljke A. montana. Potvrđeno je da geni kandidati AmGAS i AmGAO kodiraju sintazu germakrina A, odnosno oksidazu germakrina A te je potvrđena njihova enzimska aktivnost. Geni AmCYP su djelomično funkcionalno okarakterizirani, a gen AmCYP7 pokazao je najveći potencijal za daljnje istraživanje. Korelacija ekspresijskih obrazaca gena kandidata i sadržaja bioaktivnih sastojaka u tkivima biljke A. montana pokazala je da je gen AmCYP7 vjerojatno uključen u biosintezu seskviterpenskih laktona i pružila preliminarne dokaze za biosintezu seskviterpenskih laktona u različitim razvojnim stadijima biljke A. montana