Micropropagation, Somatic Embryogenesis, in vitro Conservation, and Chromosome Doubling in Cattleya tigrina A. Rich

Cattleya tigrina A. Rich., of the family Orchidaceae, is endemic in Brazil, with its distribution in the Northeast, in the Southeast and in the Southern regions. Due to its exuberance, this species is threatened with extinction, due to the devastation of the forests and by great extractive activities that are carried out by collectors and merchants. The objective of this study was to develop technologies for micropropagation, somatic embryogenesis, in vitro conservation, and chromosome duplication for the C. tigrina orchid. For the in vitro establishment, ripe fruits were collected. The capsules were opened and the seeds were isolated and inoculated in an MS culture medium, with half of the macronutrients supplemented with 30 g L-1 sucrose, 7 g L-1 agar, and 1 g L-1 activated carbon. For the in vitro multiplication, the experimental design was completely randomized in a 4x2 factorial scheme, with four volumes of the medium (10, 15, 20 and 25 mL) and with two different consistencies of the culture medium (steady and semisolid liquid). For the acclimatization, the substrates containing pine bark, charcoal, vermiculite, and coconut powder, were supplemented with 1 g.L-1 of limestone and were tested. In the somatic embryogenesis process, the young leaf explants were inserted into the MS culture medium that was supplemented with different concentrations of 2,4-D. Somatic embryos at different stages of the development were used for the histological studies. In the in vitro conservation experiments, when under slow growth, with different concentrations of the MS salts and the osmotic regulators, were tested (sucrose; sucrose: mannitol; sucrose: sorbitol) at two temperatures (18°C and 25°C). For the induction of polyploidy, the explants were treated with colchicine at concentrations of 0, 2.5, 7.5, and 12.5 mM for 24 and 48 hours, together with oryzalin at concentrations of 0, 10, 30, and 50 μM for 3 and 6 days. The confirmation of ploidy was performed by flow cytometry and stomatal analysis. The results obtained allowed for the researchers to infer that for the in vitro multiplication of the plants, the liquid culture media was stationary and that the semi-solids could be used at 10 mL for the liquid medium and at 25 mL for the semisolid medium. Acclimatization was performed by only using the pinus bark. The MS medium that was supplemented with 2,4-D (0,3 mg.L-1) induced the direct somatic embryogenesis. The histological analyses indicated that the somatic embryos originated from the cells of the epidermal layers of the leaf. The species can be conserved under a slow growth regime for a period of 730 days, by using a culture medium with 25% of the MS salts and at temperatures of 18°C or 25°C. For the osmotic regulator experiment, 20 g.L-1 of sucrose was stored at 25ºC. At the induction of polyploidy, all of the colchicine solutions and the immersion times were effective. These procedures obtained a greater number of polyploid individuals that were confirmed by flow cytometry and stomatal analysis. Oryzalin did not induce chromosome duplications at the concentrations tested.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESCattleya tigrina A. Rich. da família Orchidaceae é endêmica do Brasil com distribuição nas regiões Nordeste, Sudeste e Sul. Devido a sua exuberância, essa espécie encontra-se ameaçada de extinção, em virtude da devastação das matas ou por grande atividade extrativista, desempenhadas por colecionadores e comerciantes. Objetivou-se com o presente estudo desenvolver tecnologias para a micropropagação, embriogênese somática, conservação in vitro e duplicação cromossômica em C. tigrina. Para o estabelecimento in vitro, frutos maduros foram coletados, as cápsulas foram abertas e as sementes foram isoladas e inoculadas em meio de cultura MS, com metade dos macronutrientes, suplementadas com 30 g l-1 de sacarose, 7 g l-1 de ágar e 1 g l-1 carvão ativado. Para a multiplicação in vitro, o delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4x2, sendo quatro volumes de meio (10, 15, 20 e 25 mL) e duas consistências do meio de cultutra (líquido estacionário e semissólido). Para a aclimatização, foram testados os substratos contendo casca de pinus, carvão vegetal, vermiculita e pó de coco, suplementado com 1 g.L-1 de calcário. Na embriogênese somática explantes de folhas jovens foram inseridos no meio de cultura MS suplementados com diferentes concentrações de 2,4-D. Embriões somáticos de diferentes estádios de desenvolvimento foram utilizados para estudos histológicos. Nos experimentos de conservação in vitro, sob crescimento lento, foram testadas diferentes concentrações de sais do meio MS e reguladores osmóticos [sacarose; sacarose:manitol; sacarose:sorbitol com duas temperaturas (18 e 25°C). Na indução de poliploidia os explantes foram tratados com colchicina, nas concentrações de 0, 2,5; 7,5 e 12,5 mM, por 24 e 48 horas, e com orizalina, nas concentrações de 0, 10, 30 e 50 μM, por 3 e 6 dias. A confirmação da ploidia foi realizada através da citometria de fluxo e análise estomática. Os resultados alcançados possibilitaram inferir que, para a multiplicação in vitro das plantas, os meios de cultura líquido estacionário e semissólido podem ser utilizados, sendo 10 mL para o meio líquido estacionário e 25 mL do meio semissólido. A aclimatização pode ser realizada utilizando somente a casca de pinus. O meio MS suplementado com 2,4-D (0,3 mg.L-1) induziu a embriogênese somática direta. Análises histológicas indicaram que os embriões somáticos se originaram de células da camada epidérmica da folha. A espécie pode ser conservada sob regime de crescimento lento por um período de 730 dias, utilizando meio de cultura com 25% dos sais de MS e temperatura de 18ºC ou 25ºC. Já para o experimento com reguladores osmóticos pode-se conservar com 20 g.L-1 de sacarose à 25ºC. Na indução de poliploidia, todas as soluções e tempos de imersão de colchicina foram efetivos, obtendo maior número de indivíduos poliploides, confirmados pela citometria de fluxo e análise estomática. Orizalina não induziu a duplicação cromossômica nas concentrações testadas.São Cristóvão, S