Proteomanalyse der In-situ-Pellikel auf Dentin unter erosiven Einflüssen

Hintergrund: Der initiale Biofilm, die Pellikel, bildet sich an der Grenzfläche zwischen Zahn und Speichel durch die Adsorption von Proteinen, Glykoproteinen, Lipiden und anderen Makromolekülen des Speichels. Die Pellikel verleiht dem Zahn schützende Eigen-schaften gegen mechanische und chemische Einflüsse. Das Ziel der vorliegenden In-situ-Studie bestand darin, das Proteom des initialen Biofilms auf dem Dentin unter erosiven Einflüssen zu analysieren. Material und Methoden: Im Rahmen dieser In-situ-Untersuchungen trugen zwei Probanden an insgesamt drei unterschiedlichen Untersuchungstagen bovine Dentinprüfkörper für jeweils drei Minuten. Somit konnte sich eine 3 min In-situ-Pellikel auf insgesamt vier 8 cm2 Dentin-prüfkörperoberfläche je Proband bilden. Anschließend wurden drei dieser Probegruppen mit 0,1%, 1% oder 5% Zitronensäure für 30 s oder 60 s geätzt. Durch ein chemisches Elutionsverfahren wurden die Pellikel und die residualen Pellikel von den Prüfkörpern abgelöst. Mittels eines SDS-Gels wurden die Proteine aufgetrennt und es erfolgte eine in Gel Trypsinierung. Die Proteine wurden massenspektrometrisch über die Flüssigkeits-chromatographie-Elektronensprayionisation-Tandemmassenspektrometrie (nano LC-ESI-MS/MS) qualitativ und quantitativ analysiert. Ergänzend wurden Prüfkörper für die elektronenmikroskopischen Untersuchungen getragen und entsprechende Untersuchungen wurden durchgeführt. Ergebnisse: Insgesamt wurden 578 Pellikelproteine identifiziert, von denen sich 107 Proteine (18,38%) innerhalb dieser drei Probengruppen überschneiden. Die Anzahl der detektierten Proteine pro Proband verändert sich trotz der Säureeinwirkung nur geringfügig. In der Pellikel des Dentins sind vorwiegend Proteine mit einem Molekulargewicht von bis zu 200 kDa aufzufinden. Deren molekularen Funktionen werden zu 45% durch die Eigenschaften „Bindung“, „Strukturelle Aktivität“ und „Enzym-regulierende Aktivität“ abgebildet. Durch die Ätzung mit Zitronensäure unterschiedlicher Konzentration wurden das Verteilungsmuster der Molekulargewichte und die Verteilung molekularen Funktionen der detektierten Proteine nur geringfügig verändert. Diese Resultate korrelieren mit den elektronenmikroskopischen Befunden, die auch nach der Säureapplikation noch eine Pellikelschicht auf der Dentinoberfläche zeigen. Quantitative Untersuchungen ergaben, dass von den 13 abundantesten Proteinen insgesamt elf Proteine in allen Probengruppen aufzufinden sind. Schlussfolgerung: Es konnte eine unerwartet hohe Proteinvielfalt des initialen Biofilms auf Dentin identifiziert werden, die weitaus komplexer zusammengesetzt ist, als bisher angenommen wurde. Zum ersten Mal konnten individuelle Pellikelproteome auf Dentin für einzelne Probanden erstellt und miteinander verglichen werden. Die Ätzung mit Zitronensäure verschiedener Konzentrationen hat nur einen geringen Einfluss auf die qualitative und quantitative Zusammensetzung des Pellikelproteoms und somit ist die Protektivität der Pellikel durch eine Vielzahl an Proteinen definiert.Objectives: The initial biofilm, the pellicle, is formed at the saliva-tooth-interface through adsorption of salivary proteins, glycoproteins, lipids and other macromolecules on the dental surface. The pellicle confers protective properties against mechanical and chemical damages. The aim of this in-situ study was to analyse the pellicle proteome on dentin under erosive challenges. Material and Methods: Bovine dentin specimen were carried bucally in the vestibule of the lower jaw for 3 min, forming an in-situ pellicle on 8 cm2 dentin surface for each experimental group. Three of the four examination groups were etched with 0,1%, 1% or 5% citric acid for 30 s or 60 s. Using a chemical elution protocol the pellicle and the residual pellicle were detached from the dentinal specimen, separated by an SDS-Gel and modified by an in gel trypsination. Finally qualitative and quantitative mass spectromic analysis (nano-LC-ESI-MS/MS) and electron microscopic examinations were carried out. Results: A total of 578 pellicle proteins were identified on dentin, with an overlap of 107 proteins (18,38%). There was only a minimal change between the identified pellicle proteins of the unetched and etched experimental groups. Most of the proteins have a molecular weight up to 200 kDa. Molecular functions are mainly defined by properties „binding“, „catalytic activity“ and „enzyme regulator activity“. The influence of the citric acid with varying concentrations has only little impact on the distribution pattern of the molecular weight and on the distribution pattern of the molecular functions of the pellicle proteins. These results correlate with the electron microscopic findings, depicting a pellicle on the dentinal surface after the influence of citric acid. Quantitative analysis showed that of the 13 most abundant proteins 11 were identified in all experimental groups. Conclusion: The proteome of the 3 min in-situ-pellicle on dentin is more complex than known from literature. For the first time, an individual pellicle proteome on dentin could be provided and comparisons between the examination groups could be carried out. Citric acid in different concentrations has only little impact on the qualitative and quantitative proteome composition of 3 min biofilm on dentin. Therefore, a multiplicity of proteins seems relevant for the protective properties of the initial biofilm