TRPC6 Channel Complex : Identification of Novel Regulatory Subunits in Human Platelets

The canonical transient receptor potential channel 6 (TRPC6) is a Ca2+ permeable cation channel. To identify the TRPC6 protein containing complex in human platelets, I used antibodies against the human TRPC6, which recognized TRPC6 in platelets homogenates by Western blots. Next, I established an antibody-based affinity purification procedure to enrich the solubilized TRPC6 protein from human platelets. Under non-denaturing condition, the TRPC6 protein was eluted from the beads, run on blue native gels and analysed by mass spectrometry. By the latter approach, the G-protein-coupled receptor kinase interacting protein-1 (GIT1) and proteins of the phospholipase C-g pathway including ARHGEF, MAPK, PAK2 and IP3R were found to be associated with the TRPC6 protein. In contrast, none of these proteins were retained by non-specific immunoglobulins used as a control. TRP channels comprise four subunits, but no other TRP protein was found to be associated with TRPC6 in the human platelets indicating that TRPC6 is a homotetrameric channel. The physical interaction between TRPC6 and both GIT1 and IP3R was confirmed by coimmunoprecipitation by antibodies against all three proteins and in vitro pull-down assays. By mapping the interaction, I could show that GIT1 protein binds to the TRPC6 protein via its ankyrin repeat domain. Similarly, coimmunoprecipitation showed that the N- terminus of TRPC6 is essential for the TRPC6-GIT1 interaction. TRPC6-mediated calcium entry and currents were measured by calcium imaging and whole cell patch clamp recordings, respectively and were activated by either diacylglycerol or its membrane permeable derivative 1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol (OAG). The OAG induced calcium entry and current in HEK293 cells stably expressing the Trpc6 cDNA were reduced in the presence of GIT1 protein, indicating an inhibitory effect of GIT1 on the TRPC6-mediated calcium entry and current. In addition, in an in vitro scratch migration assay, I could show that the migration of HEK293 cells stably expressing the Trpc6 cDNA is negatively affected by GIT1 protein. Furthermore, depletion of the GIT1 protein, endogenously expressed in HEK293 cells, by the overexpressedTRPC6 N- terminus abolished the inhibitory effect of GIT1 on TRPC6 function and results in larger currents and faster cell migration. To investigate the role of TRPC6 protein in the early stages of blood haemostasis I performed platelet adhesion assays using primary human and mouse platelets. Human platelets treated with the TRPC6 agonist OAG showed an increase in platelet adhesion and this effect was significantly reduced in the presence of the TRPC6 antagonist SAR7334. Moreover, mouse platelets isolated from Trpc6 gene-deficient mice showed a significant reduction in platelet adhesion compared with platelets from wild-type controls. Taken together, this study identifies the phospholipase C-g 2 pathway to be associated with TRPC6 in platelets and especially GIT1 a novel TRPC6 channel regulatory subunit, which inhibits TRPC6 channel function. The results showing an increase of platelet adhesion after directly stimulating TRPC6 places TRPC6 downstream of receptor mediated processes initiated by fibrinogen and collagen.TRPC6 ist ein Ca2+ permeabler Ionenkanal, der zur Familie der kanonischen transient receptor potential (TRP)-Kanäle zählt. Ich habe Antikörper, die gegen das TRPC6 Protein von Mensch gerichtet sind, benutzt um solubilisiertes TRPC6 Protein aus humanen Blutblättchen anzureichern. Das an Antikörper gebundene TRPC6 Protein wurde unter nicht-denaturierenden Bedingungen eluiert, auf nativen Gelen aufgetrennt und mittels Massenspektrometrie analysiert. Durch den letzteren Versuch konnten das Adenosyl-Ribosylierungs-Faktor (ARF)-GTPase-aktivierende Protein 1 (GIT1) als auch Proteine aus der Phospholipase C Signalkaskade wie ARHGEF, MAPK, PAK2 und IP3R als Komponenten des TRPC6 Kanalkomplexes identifiziert werden. Keines dieser Proteine wurde mittels unspezifischer Immunglobuline, die als Kontrolle benutz wurden, identifiziert. TRP Kanäle bestehen aus 4 Untereinheiten, aber kein anderes TRP-Kanalprotein wurde gefunden, das an TRPC6 bindet. Das Ergebnis impliziert, das TRPC6 Kanäle in Blutblättchen als Homotetramere vorliegen. Die Interaktionen von TRPC6 jeweils mit GIT1 und IP3R wurden mittels Co-Immunopräzipitationen und Pulldown Verfahren bestätigt. Ich konnte zeigen, dass die „Ankyrin repeat“ Domäne des TRPC6 Proteins an das GIT1 Protein bindet und dass der N-terminus des TRPC6 Proteins essentiell für die Interaktion mit GIT1 ist. Die Kanalaktivität von TRPC6 wurde mittels Calcium-Imaging und Patch Clamp Strommessungen bestimmt. Die TRPC6 vermittelte Calciumaufnahme konnte durch Diacylglycerol als auch durch ein Membran-gängiges Derivat, 1-Oleoyl-2-Acetyl-sn-glycerol (OAG), aktiviert werden. In HEK293 Zellen, die stabil TRPC6 exprimieren, konnte der durch TRPC6 vermittelte Calciumeinstrom nach Expression der GIT1 cDNA vermindert werden. Die Ergebnisse zeigen, dass GIT1 einen inhibitorischen Effekt auf TRPC6 Ströme und die TRPC6-vermittelte Calciumaufnahme hat. Mittels eines Migrationversuchs, der in vitro durchgeführt wurde konnte ich zeigen das HEK293 Zellen, die stabil TRPC6 exprimieren, in Gegenwart von GIT1 langsamer migrieren. HEK293 Zellen bilden bereits endogen GIT1. Die zusätzliche Überexpression des N-terminus von ABSTRACT Universität des Saarlandes XI TRPC6 fängt das endogen gebildete GIT1 ab und hebt die Hemmung auf: Der TRPC6 vermittelte Calciumeinstrom ist erhöht und die Migration der TRPC6-HEK293 Zellen ist verstärkt. Um die Rolle von TRPC6 Kanälen in der Frühphase der Hämostase zu untersuchen habe ich einen Adhäsionstest mit humanen und murinen Blutblättchen ausgeführt. Humane Blutblättchen, die bereits mit OAG inkubiert wurden, zeigten eine verstärkte Adhäsionsneigung in vitro. Dieser Effekt war in Gegenwart des TRPC6 Antagonisten SAR7334 deutlich vermindert. Zusätzlich zeigten murine Blutblättchen, die aus TRPC6 defizienten Mäusen isoliert worden waren, eine deutlich geringere Adhäsionsneigung als Blutblättchen aus Wildtyp Mäusen. Die Arbeit zeigt, dass in Blutblättchen die Phospholipase C 2 Signalkaskade mit dem TRPC6 Protein assoziiert ist. Das GIT1 Protein, welches die Funktion des TRPC6 Kanals inhibiert, wurde als neue regulatorische Untereinheit identifiziert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass TRPC6 in der Rezeptor-vermittelten Signalkaskade, die durch Fibrinogen und Kollagen angestoßen wird „downstream“ liegt und dass TRPC6 eine Rolle bei der Adhäsion der Blutblättchen zukommt