Etudes structurales et fonctionnelles des protéines virales impliquées dans le trafic intracellulaire du génome du virus de la grippe

Influenza A virus genome, a member of the Orthomyxoviridae family, is segmented in eight negative single-stranded RNA molecules. These are entirely covered by nucleoproteins (NP) and are associated to the polymerase complex, forming the vRNPs (viral ribonucleoproteins). The virus enters the host cell by endocytosis and releases its genome in the cytoplasm. The vRNPs use the importins alpha/beta heterocomplex to reach the nucleus where the viral transcription and replication occur. The major component of the vRNPs NP may be involved in this step. As NP is an excellent candidate for antiviral drugs, we began structural studies of NP in complex with the human importin alpha 5. We obtained a first low resolution model of this complex by using the transmission electron microscopy. In the nucleus, the vRNPs are tightly bound to the chromatin. It has been shown that M1 also binds to the chromatin. Our sedimentation studies show that vRNPs bind the hisones tails whereas M1 recognizes the globular domain of the histone octamer.Late in the viral cycle, the newly synthetized vRNPs exit the nucleus. Our enzymatic essays and experiments of pull-down and sedimentation show that two viral proteins NEP and M1 mediate this nuclear export of the vRNPs by interacting with the vRNPs and the cellular exportin CRM1/RanGTP. We also obtained the crystal structure of NEP C-terminal domain involved in the recognition of M1.Le virus de la grippe appartient à la famille des Orthomyxoviridae. Son génome est segmenté en huit ribonucléoprotéines virales (vRNPS) composées chacune d'une molécule d'ARN négatif simple brin recouverte de nucléoprotéines (NP) et associée au complexe de la polymérase. Le virus entre dansla cellule hôte par endocytose, libère dans le cytoplasme ses vRNPs qui gagnent ensuite le noyau cellulaire pour être transcrites et répliquées. Les vRNPs sont importées via l'hétérocomplexe des importines alpha/beta. La NP, composant majoritaire des vRNPs, pourrait être impliquée dans cette étape et serait aussi un candidat idéal dans la mise au point de drogues antivirales. Nous avons voulu déterminer les caractéristiques structurales de NP en complexe avec l'importine alpha 5 humaine. Grâce à la technique de microscopie électronique à transmission, nous avons obtenu un premier modèle à basse résolution du complexe NP/importine alpha.Dans le noyau, les vRNPs sont étroitement liées à la chromatine. En phase tardive du cycle viral, la protéine matricielle M1 se lierait aussi à la chromatine, peut-être pour décrocher les vRNPs. Nous avons pu montrer, par la technique de sédimentation, que les vRNPs se lient aux queues des histones, alors que M1 se fixe sur le domaine globulaire des octamères d'histones.En fin de cycle viral, les vRNPs amplifiées sortent du noyau. Nos tests enzymatiques, d'interaction sur billes et en sédimentation montrent que les protéines virales M1 et NEP servent d'adaptateurs entre les vRNPs et le système d'export nucléaire CRM1/RanGTP. Nous avons aussi obtenu la structure cristallographique du domaine C-terminal de NEP se liant à M1