Etude exploratoire de la synthèse des galactolipides chez Plasmodium falciparum

Plastids are semi-autonomous organelles that derive from a unique endosymbiotic event between an ancestral eukaryotic cell and a cyanobacteria. The best characterized plastid is the chloroplast from plant cells and green algae. Differing from eukaryotic membrane systems that are naturally phospholipid-rich, plant chloroplasts membranes are composed of >70% galactoglycerolipids (monogalactosyldiacylglycerol, MGDG ; digalactosyldiacylglycerol, DGDG). Their synthesis is catalyzed by galactosyltransferases, namely MGDG synthases (EC 2.4.1.46) and DGDG synthases (EC 2.4.1.241), localized in the organelle limiting envelope membranes. In plant cells, galactolipids are essential to plastid biogenesis as well as for the composition of non-plastidial membranes under specific physiological conditions, such as phosphate deprivation.Most of the apicomplexan parasites (obligate intracellular protozoan parasites) harbour a non-photosynthetic plastid, containing a circular DNA. This organelle, called the apicoplast, is considered as a relic of an algal plastid, resulting from a secondary endosymbiosis between two eukaryotic cells, with the ingestion of a unicellular red algae by an ancestral protozoan, followed by the disappearance of most of the algal subcellular structures. Interestingly, some apicomplexan nuclear gene products are imported into the apicoplast and involved in typical plant biosynthetic pathways such as FASII fatty acids biosynthesis.Lipids with chromatographic properties similar to those of MGDG and DGDG, have been detected in Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii total extracts, suggesting the existence of a chloroplast-like galactolipid biosynthetic pathway. Using a series of antibodies directed against DGDG, a first aim of this thesis work was to investigate the localization of a chloroplastic digalactolipid-like epitope (DGLE) in P. falciparum and to determine its evolution along the parasitic cell cycle. These studies suggest that a DGLE may be associated to endomembrane systems in the cell periphery, particularly the inner membrane system. Transgenic parasites expressing an exogenous plant MGDG synthase have been generated. The remarkable accumulation of both MGDG and DGDG demonstrate that the exogenous plant enzyme is functional, catalyzing the synthesis of MGDG, and that a P. falciparum glycosyltransferase is subsequently capable of catalyzing large amounts of DGDG. The possible role of this DGDG-producing glycosyltransferase in the synthesis of the DGLE remains to be demonstrated.A second aim of this thesis consisted in the evaluation of compounds inhibiting the galactolipid synthesis for a therapeutic purpose. An automated high throughput screening of a 24000 molecule-chemolibrary allowed the identification of inhibitors of Arabidopsis thaliana MGDG synthase 1, among which two compounds harbour an inhibiting effect in the 10 µM range on MGDG synthase activity. We characterized the effect of these molecules as competitors of diacylglycerol binding. An antiparasitic activity was measured in vitro. In order to improve 1) the herbicidal effect of the lead compounds, 2) the parasite growth inhibition and to develop new antiplasmodial candidates that could be qualified as herbicidal-drugs, a structure-based diversification of the molecules was conducted. The characterization of 250 analogues allowed the optimization of the molecular selectivity with compounds being active in the 200 nM range.It cannot be excluded that molecules selected for their ability to inhibit a MGDG synthase activity could exert a distinct effect on a non-related Plasmodium falciparum target. We developed an experimental procedure to isolate the protein target(s) of the bioactive compounds by affinity chromatography against a biotinylated analogue, leading to the identification of several proteins by mass spectrometry after trypsic digestion. The development of drug candidates is a long process from the target validation to the clinical trials. The properties of the novel class of compounds characterized in this thesis work are promising. Future prospects include therefore sustained efforts to improve the antiparasitic properties of this novel class of diacylglycerol competitors.Les plastes sont des organites semi-autonomes qui dérivent d'un événement unique d'endosymbiose entre une cyanobactérie et une cellule eucaryote ancestrale. Le plaste le mieux caractérisé est le chloroplaste des cellules de plantes et d'algues vertes. À la différence des systèmes membranaires eucaryotes qui sont en général riches en phospholipides, les membranes des plastes végétaux se composent à plus de 70% de galactoglycérolipides (monogalactosyldiacylglycérol, MGDG ; digalactosyldiacylglycérol, DGDG). Leur synthèse est assurée par des galactosyltransférases, les MGDG synthases (EC 2.4.1.46) et les DGDG synthases (EC 2.4.1.241) localisées dans les membranes de l'enveloppe qui limitent l'organite. Chez les plantes, les galactolipides sont essentiels pour la biogenèse des plastes mais aussi à la synthèse de membranes extraplastidiales sous certaines conditions physiologiques telles qu'en carence de phosphate.La plupart des parasites Apicomplexes (protozoaires parasites à mode de vie intracellulaire) possèdent une structure plastidiale, non photosynthétique, contenant un ADN circulaire. Cet organite, baptisé apicoplaste, a pour origine phylogénétique une endosymbiose secondaire entre deux eucaryotes, avec ingestion d'une algue rouge unicellulaire par un protozoaire ancestral, suivie d'une disparition de la plupart des structures subcellulaires de l'algue. Des protéines codées par des gènes nucléaires sont importées dans l'apicoplaste et impliquées dans des voies métaboliques typiques des plantes telles que la biosynthèse d'acides gras par le système FASII.Des lipides aux propriétés chromatographiques proches de celles du MGDG et du DGDG ont pu être détectés dans des extraits de Plasmodium falciparum et Toxoplasma gondii, suggérant l'existence d'une voie de biosynthèse des galactolipides comparable à celle existant dans le chloroplaste. Au moyen d'une série d'anticorps dirigés contre le DGDG, un premier objectif de ce travail de thèse a été de caractériser la localisation d'un épitope de structure proche du digalactolipide chloroplastique (DGLE pour digalactolipid-like epitope) chez P. falciparum et déterminer l'évolution de la distribution subcellulaire de cet épitope au cours du cycle cellulaire du parasite. Ces études suggèrent qu'un lipide de structure proche du DGDG est associé à des systèmes membranaires en périphérie de la cellule, en particulier le complexe membranaire interne. Des parasites transgéniques exprimant une MGDG synthase exogène de plante ont été générés. L'accumulation remarquable à la fois de MGDG et de DGDG chez ces transformants démontre d'une part que l'enzyme de plante est fonctionnelle, catalysant la synthèse de MGDG, et d'autre part qu'une glycosyltransférase de P. falciparum est capable ensuite de catalyser de grandes quantités de DGDG. Le rôle possible de cette glycosyltransférase dans la synthèse du DGDG reste à établir. Un second objectif de cette thèse était d'évaluer le potentiel dans P. falciparum de composés inhibant la synthèse des galactolipides de plante dans une visée thérapeutique. Un criblage à haut débit robotisé d'une banque de 24.000 molécules nous a permis d'identifier des inhibiteurs de la MGDG synthase 1 d'Arabidopsis thaliana, parmi lesquels deux composés présentent un effet inhibiteur mesuré par une CI50 de l'ordre 10 µM sur l'activité MGDG synthase. Nous avons pu caractériser l'effet de ces molécules comme compétiteurs de la fixation du diacylglycérol. Une activité inhibitrice de la prolifération de P. falciparum a pu être mesurée in vitro bien qu'aucune enzyme homologue à la MGDG synthase n'ait pu être identifiée in silico sur les banques de données relatives aux Apicomplexes. Une diversification de la structure du châssis moléculaire a été conduite afin d'améliorer 1) l'effet herbicide et 2) l'inhibition de la croissance des parasites et de développer ainsi de nouvelles molécules antipaludiques, qui puissent être qualifiées de médicaments herbicides. L'étude de 250 analogues a permis de progresser de façon substantielle dans le sens d'une meilleure sélectivité avec des composés actifs à 200 nM.Il n'est pas exclu que les molécules sélectionnées pour leur capacité à inhiber une activité MGDG synthase exercent, chez P. falciparum, un effet sur une autre cible. Nous avons conduit une expérience visant à isoler la(les) protéine(s) cible(s) des molécules bioactives par chromatographie d'affinité, puis identifié ces protéines après digestion trypsique par spectrométrie de masse. Une perspective de ce travail consiste à caractériser certaines de ces cibles candidates.Le développement de candidats-médicaments est un processus long selon le schéma classique, depuis la validation d'une cible jusqu'aux essais cliniques. La nouvelle classe de compétiteurs du diacylglycérol caractérisée dans ce travail de thèse présente des propriétés intéressantes dans une visée thérapeutique, qu'il sera important d'optimiser dans l'avenir