Produção de astaxantina e extratos com atividade biológica por Haematococcus pluvialis e Tetradesmus obliquus

Orientadora: Profª. Drª Vanessa M. KavaCoorientadores: Prof. Dr. José V. C. Vargas, Prof. André B. MarianoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 30/06/2020Inclui referênciasResumo: O cultivo de microalgas tem atraído a atenção de pesquisadores e indústrias de biotecnologia muitas vezes devido ao potencial valor agregado da sua biomassa. Ácidos graxos poli-insaturados, carboidratos, proteínas e carotenoides estão presentes nesta biomassa e muitos desses compostos possuem ação antioxidante, atividade antimicrobiana e bioestimulante de crescimento vegetal. No intuito de melhorar a obtenção destes bioprodutos, diferentes estratégias de cultivos podem ser avaliadas. A utilização de luz azul em conjunto com a privação de nitrogênio é uma estratégia conhecida para o aumento da produção de astaxantina, por exemplo. A indução de crescimento mixotrófico, com a adição de compostos orgânicos ao meio de cultura, também pode resultar no aumento de produção destas substâncias pelas microalgas. O estudo de genes expressos diferencialmente em diferentes condições de cultivo pode apontar para estratégias de melhoramento genético, incluindo modificações genéticas. Nesse sentido, o objetivo desse estudo foi avaliar a produção de carboidratos, lipídeos, proteínas e astaxantina em diferentes condições de cultivos das microalgas Haematococcus pluvialis e Tetradesmus obliquus. A expressão de genes carotenogênicos (fitoeno sintase, licopeno B-ciclase, B-caroteno cetolase e B-caroteno hidroxilase) foi avaliada em cultivos de H. pluvialis, expostos à luz azul, vermelha ou branca, sendo esta última o controle. Também foram obtidos extratos da biomassa de H. pluvialis e T. obliquus para avaliar a atividade antimicrobiana e a indução de crescimento vegetal. Sob a luz azul, H. pluvialis produziu 8 vezes mais astaxantina em comparação aos cultivos com luz branca ou vermelha. Transcritos de genes carotenogênicos confirmaram a resposta à luz azul, após terem sua expressão aumentada. Neste experimento também foi observado que as diferentes condições luminosas não resultaram em diferenças no acúmulo de lipídeos. Por outro lado, os cultivos em luz branca produziram o maior teor de proteínas, alcançando 32%, enquanto os cultivos em luz vermelha acumularam o maior teor de carboidratos, chegando a 29%. Em cultivos mixotróficos de H. pluvialis, a adição de 1 g L-1 de glicerol aumentou significativamente o acúmulo de lipídeos, carboidratos e astaxantina. Já nos cultivos de T. obliquus, a concentração de glicerol de 5 g L-1 proporcionou uma produção de 1 g L-1 de biomassa com 23% de lipídeos, após 10 dias. Extratos brutos de H. pluvialis e T. obliquus, obtidos com água ou acetona, com concentrações variando de 6,7 mg L-1 a 0,1 Mig L-1 não inibiram o crescimento de Acinetobacter baumannii e Enterococcus Resistente à vancomicina. Por outro lado, o extrato aquoso (TW) obtido da biomassa de T. obliquus cultivada sem glicerol apresentou atividade bioestimulante de crescimento vegetal. A partir destes resultados foi possível concluir que a luz azul e a adição de glicerol são alternativas viáveis à produção de biomassa e compostos com valor agregado. Além disso, a luz azul com intensidade de 20 Mimolfótons m-2 s-1 em conjunto com a privação de nitrogênio foi suficiente para aumentar o número de transcritos dos genes relacionados com a síntese de astaxantina. Embora o extrato TW tenha respondido com sucesso como bioestimulante de crescimento vegetal, devem ser avaliadas novas estratégias de extração e a utilização de concentrações maiores de extratos.Abstract: The cultivation of micro-algae has attracted the attention of researchers and biotechnology industries, often due to the potential added value of their biomass. Polyunsaturated fatty acids, carbohydrates, proteins, and carotenoids are present in this biomass and many of these compounds have antioxidant action, antimicrobial activity, and bio-stimulant for plant growth. To improve the obtaining of these bioproducts, different cultivation strategies can be evaluated. The use of blue light in conjunction with nitrogen deprivation is a known strategy for increasing the production of astaxanthin, for example. The induction of mixotrophic growth, with the addition of organic compounds to the culture medium, can also result in increased production of these substances by micro-algae. The study of genes differentially expressed in different culture conditions may point to strategies for genetic improvement, including genetic modifications. In this sense, the objective of this study was to evaluate the production of carbohydrates, lipids, proteins, and astaxanthin under different cultivation conditions of the micro-algae Haematococcus pluvialis and Tetradesmus obliquus. The expression of carotenogenic genes (phytoene synthase, lycopene B-cyclase, B-carotene ketolase, and B-carotene hydroxylase) was evaluated in cultures of H. pluvialis, exposed to blue, red or white light, the latter being the control. Extracts from the biomass of H. pluvialis and T. obliquus were also obtained to evaluate antimicrobial activity and induction of plant growth. Under blue light, H. pluvialis produced 8 times more astaxanthin compared to crops with white or red light. Transcripts of carotenogenic genes confirmed the response to blue light after their expression was increased. In this experiment, it was also observed that the different light conditions did not result in differences in the accumulation of lipids. On the other hand, white light crops produced the highest protein content, reaching 32%, while red light crops accumulated the highest carbohydrate content, reaching 29%. In mixotrophic cultures of H. pluvialis, the addition of 1 g L-1 of glycerol significantly increased the accumulation of lipids, carbohydrates and astaxanthin. In the cultures of T. obliquus, the glycerol concentration of 5 g L-1 provided a production of 1 g L-1 of biomass with 23% lipids, after 10 days. Crude extracts of H. pluvialis and T. obliquus, obtained with water or acetone, with concentrations ranging from 6.7 mg L-1 to 0.1 Mig L-1 did not inhibit the growth of Acinetobacter baumannii and Vancomycin-resistant Enterococcus. On the other hand, the aqueous extract (TW) obtained from the biomass of T. obliquus grown without glycerol showed bio-stimulating activity of plant growth. From these results it was possible to conclude that blue light and the addition of glycerol are viable alternatives to the production of biomass and compounds with added value. In addition, the blue light with an intensity of 20 Mimol m-2 s-1 together with nitrogen deprivation was sufficient to increase the number of gene transcripts related to astaxanthin synthesis. Although the TW extract has responded successfully as a plant growth stimulant, new extraction strategies and the use of higher concentrations of extracts should be evaluated