Polissacarídeos quimiotransformados de farelo de soja como alternativa aos antibióticos no controle de bactérias enteropatogênicas

Orientador: Profº Drº Miguel Daniel Noseda.Coorientadora: Profª Drª Maria Eugênia Duarte Noseda.Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa : Curitiba, 23/02/2016.Inclui referências: p. 270-277.Área de concentração:Resumo: O presente trabalho objetivou caracterizar a estrutura química fina dos polissacarídeos quimiotransformados de farelo de soja, e avaliar suas capacidades de ligação e inibição da adesão in vitro a bactérias enteropatogênicas. Para tanto, uma solução de farelo de soja (150 g L-1) teve seu pH ajustado para 2,0 e foi submetida a um tratamento térmico (120°C, 1 atm, 1 h). Após filtração, neutralização e centrifugação, o sobrenadante obtido foi submetido a um novo processo térmico (120°C, 1 atm, 15 min). A solução final foi então tratada com TCA e em seguida os polissacarídeos foram precipitados com etanol. Esta fração polissacarídica foi fracionada e submetida a análises químicas e espectroscópicas para determinação da estrutura química. Adicionalmente, as frações foram avaliadas in vitro quanto à capacidade de adesão à Salmonella enterica sv. Typhimurium, usando um produto comercial e BSA como controles positivo e negativo, respectivamente. Estes resultados foram analisados estatisticamente pelo programa R usando uma equação sigmoidal que descreve a cinética de crescimento bacteriano. A fração bruta (FS-Ep) apresenta alto teor de carboidratos (85,0%) e baixo teor de proteínas (4,7%). As demais frações obtidas (FS-R, FS-Tp, FS-A e FS-Es) apresentaram elevados teores de proteínas (39,1 - 86,8%) e menores teores de carboidratos (8,7 - 37,2%). Todas as frações apresentaram galactose, arabinose e ácido urônico como monossacarídeos principais. O fracionamento de FS-Ep permitiu a identificação de dois grupos de moléculas: um primeiro grupo de alta massa molar (Mw = 500 kDa), composto de pectinas parcialmente despolimerizadas, com unidades de a-D-GalpA-(1 - 4)-ligadas e cadeias laterais de a-LAraf-(1 - 5)-ligadas e B-D-Galp-(1 - 4)-ligadas; e um segundo grupo composto por uma B-D-galactana (1 - 4)-ligada de baixa massa molar (Mw = 8 kDa). Com exceção da fração composta por pectinas purificadas, todas as demais frações apresentaram capacidade de aderir a enterobactérias, apresentando resultados estatisticamente equivalentes ao produto comercial, mostrando-se como potenciais substitutos. Os resultados indicam que a presença de manose não é o único fator responsável pela ligação da bactéria às moléculas de interesse, outros fatores/biomoléculas participam do processo de adesão. Delineamento experimental do tipo DCCR permitiu otimização das condições de extração do farelo de soja em função do rendimento do processo e obtenção de extratos com alta capacidade de adesão a enterobactérias. Os rendimentos dos extratos brutos foram elevados em 10x, passando de 7,9% (extrato bruto FS-A, antes da otimização) para 77,3% (extrato CS). Os melhores rendimentos (53,9 e 77,3%) e extratos com maiores atividades de adesão a enterobactérias (219,9 e 215,8% em relação ao controle positivo) foram obtidos em pH 0,5, 60 min e [farelo] de 300 g-L-1 e pH 13,0, 60 min e [farelo] de 300 g-L-1. Análises indicam a presença de proteínas e carboidratos nos extratos biologicamente ativos. Adicionalmente, resultados demonstram que os extratos de farelo de soja mantêm atividade após processo de digestão, bem como apresentam potencial de inibir a adesão de enterobactérias a receptores análogos conhecidos. Todos os resultados em conjunto demonstram o potencial econômico e biotecnológico dos extratos quimiotransformados de farelo de soja na prevenção de infecções causadas por enterobactérias, e uma das consequências esperadas de sua utilização pode ser a redução do uso de antibióticos na pecuária.Abstract: This study aimed to characterize the fine chemical structure of chemotransformed polysaccharides from soybean meal and evaluate their binding capacity and inhibition of adhesion in vitro to enteropathogenic bacteria. For this purpose, a soybean meal solution (150 g-L-1) had its pH adjusted to 2.0 and was subjected to a heat treatment (120°C, 1 atm, 1 h). After filtration, neutralization and centrifugation, the supernatant obtained was subjected to a new thermal process (120°C, 1 atm, 15 min). The final solution was then treated with TCA and then the polysaccharides were precipitated with ethanol. This polysaccharide fraction was fractioned and subjected to chemical and spectroscopic analysis to determine the chemical structure. In addition, the fractions were evaluated in vitro for their ability to adhere to Salmonella enterica sv. Typhimurium, using a commercial product and BSA as positive and negative control, respectively. The results were statistically analyzed in the R software following a sigmoidal equation that describes the kinetics of bacterial growth. Crude fraction (FS-Ep) had a high carbohydrate content (85.0%) and low protein content (4.7%). The remaining fractions obtained (FS-R, FS-Tp, FS-A and FS-Es) had elevated protein levels (39.1 to 86.8%) and lower carbohydrate content (8.7 to 37.2%). All fractions showed galactose, arabinose and uronic acid as main monosaccharides. The FS-Ep fractionation allowed the identification of two groups of molecules: a first group of high molecular weight (Mw = 500 kDa), composed of partially depolymerizated pectins, with units a-D-GalpA-(1 - 4)-linked units as main chain and (1 - 5)-linked-a-L-A raf and (1 - 4)-linked-B-D-Galp side chains; and a second group composed of a B-D-Galactan (1 - 4)-linked of low molar mass (Mw = 8 kDa). Except for the fraction consisting of purified pectins, all other fractions showed ability to adhere to the enterobacteria, with statistically equivalent results to the commercial product, showing up as potential replacements. The results indicate that the presence of mannose is not the only factor responsible for the binding of the bacteria to the molecules of interest, other factors/biomolecules participate in the adhesion process. Experimental design, type CCRD, allowed optimization of the soybean meal extraction conditions on the yield of the process and obtain extracts with high capacity of adherence to the enterobacteria. The yields of the crude extracts were high at 10x, going from 7.9% (crude extract FS-A, before optimization) to 77.3% (CS extract). The best yields (53.9 and 77.3%) and extracts with activity greater adhesion to the enterobacteria (219.9 and 215.8% compared to the positive control) were obtained at pH 0.5, 60 min and [meal] 300 g-L-1 and pH 13.0, 60 min, [meal] 300 g-L-1. Analyzes indicate the presence of protein and carbohydrates in biologically active extracts. Furthermore, results demonstrate that soy meal extracts retain activity after digestion process and have the potential to inhibit the adhesion of enterobacteria to known analogue receptors. All the results together demonstrate economic and biotechnological potential of the chemotransformed extracts from soybean meal in preventing infections caused by enterobacteria, and as an expected consequence of their use may be to reduce the use of antibiotics in livestock