Effect of Subinhibitory Concentrations of Erythromycin on Biofilm Formation and Virulence by Edwardsiella piscicida

어병세균인 Edwardsiella piscicida는 담수와 해수에 서식하는 어류에 에드와드증을 일으키는 인수공통감염 병원체로 알려져 있다. 이러한 감염원은 전세계적으로 수산양식업에 거대한 경제적 손실을 일으킨다. 어류용 백신 개발의 경제적 한계로 수산양식업에서는 세균성 감염 치료를 위해 주로 항생제를 사용하고 있다. 그러나, 무분별한 항생제의 오남용은 다재약재내성균의 등장을 유도하는 등의 부작용을 초래하고 있다. E. piscicida는 생물막을 포함한 다양한 병원성 인자를 가지고 있다. 생물막은 자연환경 표면에 부착하고 숙주에 군집화를 이루며 살아가는데 중요한 역할을 한다. 생물막 형성은 물리적, 화학적 신호에 의해 조절되지만, E. piscicida의 생물막 형성 조절기전에 관한 연구는 아직 부족한 실정이다. 다양한 병원성 세균에서의 선행 연구결과에 의하면 생물막 형성은 항생제의 부억제성 농도에 의해 조절된다고 보고된 바 있다. 본 연구에서는 수산양식업에서 널리 쓰이는 에리트로마이신의 부억제성 농도가 E. piscicida의 생물막 형성을 조절하며, 이로 인한 병원성 인자 발현 및 숙주에서의 감염성 변화를 유도할 수 있을 것이라는 가설을 세웠다. RNA-seq DEG분석을 통하여, 에리트로마이신의 부억제성 농도는 E. piscicida의 type 1 fimbrial 유전자 발현을 증가시킴과 동시에 운동성 관련 유전자의 발현은 감소시킴을 확인하였다. DEG 결과를 확인하기 위해 에리트로마이신의 부억제성 농도에 노출된 E. piscicida 실험군과 일반 배지에서 자란 대조군 E. piscicida의 type 1 fimbrial fimA 와 flagellar protein flhB의 발현 변화 양상을 qRT-PCR을 통해 확인하였다. Crystal violet assay을 통하여 실험군에서 대조군에 비해 생물막의 형성이 증가됨을 확인하였고, soft agar assay를 통해 운동성은 감소하는 결과를 확인하였다. 나아가 EPC 세포주를 활용한 세균의 부착 및 침입 실험을 통해 실험군이 대조군에 비해 더 많은 양의 세균이 숙주 세포로 부착·침입 함을 확인하였다. 마지막으로, 제브라피쉬를 이용한 동물실험에서 실험군이 대조군에 비해 낮은 LD50를 나타냄을 확인함으로서 부억제성 농도의 에리트로마이신에 노출된 E. piscicida가 더 높은 병원성을 나타내는 것을 실험적으로 증명하였다. 종합적으로, 에리트로마이신의 부억제성 농도는 E. piscicida의 type 1 fimbriae 발현을 통해 생물막 형성을 유발하고, 이는 숙주의 표면에 군집화 증가를 유도하여 병원성이 증가하는 결과를 나타내었다. 본 연구 결과는 수산양식업에서 항생제의 무분별한 사용은 다재약재내성균의 등장을 유도할 뿐만 아니라 기존 병원균의 병원성 인자 발현 조절을 유도하여 감염 시 어류 숙주의 사망률 증가를 유도할 수 있음을 제시하였다. 이를 통해 본 연구는 E. piscicida에서 병원성 인자의 활성화시키는 부억제성 농도의 항생제는 숙주와 병원체 사이의 발병기전에 대한 새로운 정보를 제공하고 양식장에서 세균 감염을 치료하고 예방하기 위해 사용되는 항생제 의존적인 치료법의 재고와 신중성을 강조한다.1. Introduction 1 2. Materials and Methods 6 2.1 Bacterial strains, plasmids, and culture conditions 6 2.2 General DNA manipulations 6 2.3 Site-directed mutagenesis 9 2.4 Determination of growth kinetics for sub-MIC 9 2.5 Total RNA sequencing using Nugen Universal Prokaryotic RNA Library prep kit method 10 2.6 Biofilm assay 11 2.7 Scanning Electron Microscope (SEM) 11 2.8 Congo red agar assay 12 2.9 Quantitative real-time PCR 13 2.10 Overexpression and purification of recombinant proteins 15 2.11 Sodium Dodecyl Sulfate-Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) 16 2.12 Precipitation of secretory proteins using TCA 16 2.13 Construction of fimA polyclonal antibody in BALB/c mouse 17 2.14 Immunoblotting analysis 18 2.15 TEM (Transmission Electron Microscopy) 18 2.16 Motility assay 19 2.17 EPC cell culture 19 2.18 Cell internalization assay 20 2.19 Cell invasion assay 20 2.20 Infection of zebrafish 21 2.21 Statistical analysis 21 2.22 Ethical statement 22 3. Result 23 3.1 Kinetic determination for sub-MIC of erythromycin 23 3.2 Transcriptional profiling at the sub-MIC of erythromycin 25 3.3 Observation of biofilm formation by sub-MIC of erythromycin 30 3.4 Observation of EPS secretion by sub-MIC of erythromycin 33 3.5 Expression analysis of genes involved in biofilm formation by sub-MIC of erythromycin 35 3.6 Production of polyclonal antibodies specific for fimA 37 3.7 Identification quantification of fimA by sub-MIC of erythromycin 40 3.8 Observation of type 1 fimbriae formation by sub-MIC of erythromycin 42 3.9 Characteristic of motility by sub-MIC of erythromycin 44 3.10 Increased cell adhesion and invasion by sub-MIC of erythromycin 46 3.11 Infection assay and LD50 determination in zebrafish 48 4. Discussion 51Maste