Structural and biophysical studies in hemicellulose-degrading enzymes for industrial biotechnology applications

As paredes celulares das plantas são estruturas que possuem diversas funções, entre elas conferir sustentação e proteção às mesmas. Essas paredes são formadas basicamente por celulose, hemicelulose e lignina, além de outros compostos minoritários. A hemicelulose, o segundo componente mais abundante, que responde por cerca de 30% da parede celular, é composta por xilano, um polímero de xilose com decorações como arabinose e ácido metil-glucurônico, o que a torna um material recalcitrante. Para a degradação da hemicelulose e aproveitamento dos açúcares contidos nela, se faz necessária a hidrólise eficiente desse componente. O presente estudo teve como alvos enzimas degradadoras de xilano com a finalidade de produção de compostos de interesse industrial, como xilo-oligossacarídeos (XOS), xilose, que seria o monômero da cadeia de xilano, e xilulose, um isômero da xilose. Os XOS são conhecidos por serem prebióticos, com grande importância na indústria alimentícia e promovendo saúde e bem-estar. Já a xilulose é uma pentose aproveitada na produção de etanol por fermentação industrial, ao contrário da xilose, que não pode ser aproveitada nas mesmas condições. As enzimas estudadas foram as glicosil-hidrolases, ou GHs, sendo mais especificamente as GHs 10, 11 e 43, e a xilose isomerase. Foram utilizadas técnicas físicas para caracterização destas enzimas e entendimento sobre o mecanismo das mesmas. A GH10, que se mostrou uma boa produtora de XOS, teve desvendada o seu padrão de clivagem enzimático e conseguiu-se compreender a relação entre a estrutura cristalográfica da enzima e o perfil de produtos gerados pela mesma. A GH11, que possui um perfil enzimático incomum, indicando cooperatividade, teve a sua estrutura cristalográfica resolvida e, através de simulações de dinâmica molecular, compreendeu-se o papel do sítio secundário de ligação na estabilização da enzima e na diminuição da energia livre de interação com o ligante. A GH43, que possui afinidade maior por XOS maiores e cujo mutante F507A não apresenta atividade catalítica, teve sua estrutura cristalográfica resolvida, e através de análises estruturais e simulações de dinâmica molecular, compreendeu-se que as dobras que o ligante fazia em direção à enzima poderiam resultar em interações extras em XOS maiores, além do fato da mutação F507A estreitar o bolso catalítico da enzima, impedindo a acomodação de um ligante e consequentemente a atividade catalítica da mesma. Para a xilose isomerase, foram feitos extensivos estudos de caracterização, com a determinação de parâmetros como temperatura ótima (60 °C), pH ótimo (cerca de 8.0), termoestabilidade (50% de atividade residual após 72h a 50 °C), além de raio de giro (36 Å), determinação da estrutura cristalográfica, além de análises de conservação dos resíduos no grupo. Ensaios preliminares de fermentação foram realizados, mas outros testes, com diferentes técnicas de fermentação, devem ser realizados para encontrar a melhor forma de utilizar industrialmente essa enzima.Plant cell walls are structures that have several functions, including providing support and protection to them. These walls are basically formed by cellulose, hemicellulose and lignin, in addition to other minority compounds. Hemicellulose, the second most abundant component, which accounts for about 30% of the cell wall, is composed of xylan, a xylose polymer with decorations such as arabinose and methyl-glucuronic acid, which makes it a recalcitrant material. For the degradation of hemicellulose and the use of the sugars contained in it, the efficient hydrolysis of this component is necessary. The present study aimed at xylan degrading enzymes with the purpose of producing compounds of industrial interest, such as xylo-oligosaccharides (XOS), xylose, the monomer of the xylan chain, and xylulose, an isomer of xylose. XOS are known to be prebiotics, with great importance in the food industry and promoting health and well-being. Xylulose, on the other hand, is a pentose used in the production of ethanol by industrial fermentation, unlike xylose, which cannot be used under the same conditions. The enzymes studied were glycosyl hydrolases, or GHs, more specifically GHs 10, 11 and 43, and xylose isomerase. Physical techniques were used to characterize these enzymes and understand their mechanism. GH10, which proved to be a good producer of XOS, had its enzymatic cleavage pattern unraveled and it was possible to understand the relationship between the crystallographic structure of the enzyme and the profile of products generated by it. GH11, which has an unusual enzymatic profile indicating cooperativity, had its crystallographic structure resolved and, through molecular dynamics simulations, the role of the secondary binding site in stabilizing the enzyme and lowering the free energy of interaction was comprehended and described with the binder. GH43, which has greater affinity for larger XOS and whose F507A mutant does not present catalytic activity, had its crystallographic structure resolved, and through structural analysis and molecular dynamics simulations, it was understood that the folding that the ligand made towards the enzyme could possibly result in extra interactions in larger XOS, in addition to the fact that the F507A mutation narrows the catalytic pocket, preventing the accommodation of a ligand and consequently abolishing the enzymatic catalytic activity. For xylose isomerase, extensive characterization studies were carried out, with the determination of parameters such as optimal temperature (60 °C), optimal pH (about 8.0), thermostability (50% residual activity after 72h at 50 °C), in addition to radius of gyration (36 Å), determination of the crystallographic structure, as well as analyzes of conservation of residues in the group. Preliminary fermentation tests have been carried out, but other tests, with different fermentation techniques, must be carried out to find the best way for industrially usage of this enzyme