Bioreactor studies and analysis of metabolic fluxes in recombinant Burkholderia sacchari strains in the conversion of xylose and hexanoic acid into poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate copolymers [P(3HB-co-3HHx)].

O impacto ambiental de produtos de origem petroquímica, como os plásticos, têm levado à busca por materiais similares que sejam ambientalmente corretos e possam ser produzidos a partir de fontes renováveis. Uma alternativa são os polihidroxialcanoatos (PHA), uma família de poliésteres termoplásticos ou elastoméricos, biodegradáveis e biocompatíveis, acumulados por algumas bactérias. A incorporação e a modulação de monômeros variáveis à estrutura dos PHA apresentam potencial para o desenvolvimento de novos materiais para aplicações médicas. A literatura e patentes recentes apontam copolímeros de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato (3HB-co-3HHx) como produtos de grande potencial nesta área. Foram construídos, no laboratório de Bioprodutos do Instituto de Ciências Biomédicas-USP, recombinantes da bactéria Burkholderia sacchari, abrigando genes de Aeromonas sp, com o objetivo de se ter um organismo seguro capaz de produzir altos teores do copolímero. Este trabalho estudou aspectos da produção do copolímero 3HB-co-3HHx a partir de xilose e ácido hexanóico, por esses recombinantes, para dar subsídios à produção deste material com diferentes teores de 3HHx, potencialmente capazes de conferir variações nas propriedades e aplicações deste. Analisaram-seos perfis desses recombinantes, frente ao consumo de xilose e ácido hexanóico, para propor alternativas metabólicas para o aprimoramento no consumo de xilose por esses mutantes a partir da análise de fluxos metabólicos. A xilose foi selecionada como principal fonte de carbono por ser uma pentose oriunda de hidrolisados hemicelulósicos do bagaço de cana-de-açúcar que se apresenta como um resíduo da produção de etanol de segunda geração. Foram testados seis recombinantes, abrigando os genes P, C e J de Aeromonas sp. ou Aeromonas hydrophila, em frascos agitados, selecionando-se o recombinante B. sacchari LFM344 pBBR1MCS-2::phaPCJAsp para ensaios em biorreator.Esses experimentos, em meio de cultura contendo xilose mais ácido hexanóico como fontes de carbono,permitiram delimitar: a velocidade específica máxima de crescimento (&#956 maxX=0,18 h,-1), a eficiência de conversão de xilose em monômeros de 3HB (Y3HB/xil=0,40 g.g-1) e a eficiência de conversão de ácido hexanóico em monômeros de 3HHx (Y3HHx/AHex=0,89 g.g-1), este último maior do que dados reportados na literatura.Foram propostas e aplicadas condições para experimentos visando modular o teor de 3HHx no copolímero a partir de xilose e ácido hexanóico em biorreator.As células foram capazes de acumular entre35 a 64% da biomassa na forma de PHA.Os teores de 3HHx nos copolímeros variaram de 10 mol% a 40mol %, mostrando que é possível controlar a composião monomérica e as propriedades do material. Os valores obtidos foram superiores a experimentos da literatura com glicose e ácido hexanóico. Finalmente, utilizaram-se os programas Metatool e Matlab para analise preliminar de fluxos metabólicos, sendo observada a necessidade de se melhorar a produção de poder redutor (NADPH) pela célula.The environmental impact of products of petrochemical origin, such as plastics, has led to the search for similar materials that are environmentally friendly and can be produced from renewable sources. An alternative is the polyhydroxyalkanoates (PHA), a family of thermoplastic or elastomeric polyesters, biodegradable and biocompatible, accumulated by some bacteria. The incorporation and modulation of variable monomers to the PHA structure present potential for the development of new materials for medical applications. Recent literature and patents have reported poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate copolymers (3HB-co-3HHx) as products of great potential in this area. Burkholderia sacchari recombinants, harboring Aeromonas sp. genes, were constructed in the laboratory of Bioproducts of the Institute of Biomedical Sciences-USP, with the objective of having a safe organism capable of producing high levels of the copolymer. This work studied some aspects of the production of 3HB-co-3HHx from xylose and hexanoic acid, by these recombinants, to subsidize the production of this material with different levels of 3HHx, potentially conferring improved propertiesto the copolymer and widening its applications.Recombinants profiles in xylose and hexanoic were analyzed, to propose metabolic alternatives to improve xylose consumption based on metabolic flux analysis. Xylose was selected as the main carbon source due to the fact that, besides being a significant component of sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysates, it isa residue of second generation ethanol production. Six B. sacchari recombinants, harboring genes P, C and JfromAeromonas sp. or Aeromonas hydrophila, were tested shaken flasks; recombinant B. sacchari LFM344 pBBR1MCS-2 :: phaPCJAsp was selected for bioreactor experiments. The parameters delimited were: the maximum specific growth rate (&#956maxX = 0,18 h-1), the efficiency in converting xylose to 3HB monomers (Y3HB / xil = 0,40 g.g-1), the efficiency in converting hexanoic acid to 3HHx monomers (Y3HHx / AHex = 0,89 g.g-1) in culture medium containing xylose plus hexanoic acid as carbon sources. Conditions were proposed and applied in order to modulate 3HHx content in the copolymer. Cells were able to accumulate from 35 to 64% of cell dry biomass as PHA. 3HHx content in the copolymers ranged from 10 mol% to 40 mol%, evidencing the possibility of controling monomers composition and thus polymer properties. Moreover, those figures were higher than previous values from the literature. Finally, Metatool and Matlab programs were tested as a preliminary analysis of metabolic fluxes, indicating the the need for the cell to improve reducing power production (NADPH)