Physiological ano molecular characteriza tion of tobacco transgenic plants expressing soybean leghemoglobin inside chloroplasts

O oxigênio é essencial no processo respiratório e participa tanto no metabolismo primário quanto no secundário das células vegetais. Várias tentativas têm sido feitas no sentido de interferir no metabolismo aeróbico das plantas, especialmente no que se refere às reações de oxigenação ou carboxilação da Rubisco. O desenvolvimento de uma proteína Rubisco (ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase) mais eficiente é problemático, pois sua manipulação estrutural conduz frequentemente a um aumento da atividade oxigenase, que é responsável direta pelas perdas geradas durante o processo fotorrespiratório. A fim de reduzir a disponibilidade de oxigênio no interior dos cloroplastos foi construído um gene quimérico formado pelo cDNA da leghemoglobina de soja (Iba) ligado ao fragmento de DNA que codifica a sequência de direcionamento aos cloroplastos da pequena subunidade da Rubisco de ervilha. Esta construção foi introduzida em Nicotiana tabacum via transformação genética utilizando Agrobacterium tumefaciens. A análise das plantas transgênicas revelou que a leghemoglobina foi eficientemente importada e corretamente processada no interior dos cloroplastos de tabaco. Além disso, o nível máximo de expressão da Lba no tecido foliar variou de 0,01 a 0,1%. A análise fotossintética, produção de metabólitos (amido e sacarose) e enzimas envolvidas no metabolismo aeróbico das células (catalase [CAT], glutationa redutase [GR] e superóxido dismutase [SOD]) revelaram que, apesar da alta afinidade da leghemoglobina ao oxigênio, nenhuma diferença significativa foi observada quando comparada com as das plantas controle. Esses resultados sugerem que uma concentração muito elevada de leghemoglobina precisa estar presente no interior da organela para que ela possa agir transportando ou facilitando a difusão do oxigênio.Oxygen is essential for respiration and also participates in the primary and secondary metabolism of plant cells. Severa! attempts have been made to alter the aerobic metabolism in plants, especially those related to the oxygenation or carboxylation of Rubisco (ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase). However, designing a more effective Rubisco protein is rather problematic since its structural manipulation leads frequently to an enhancement of oxygenase activity, which is responsible for photorespiratory losses. ln order to reduce oxygen availability inside chloroplasts a chimeric gene, consisting of a soybean leghemoglobin cDNA (Iba) bound to the chloroplast targeting signal sequence of the Rubisco small subunit gene was introduced and expressed in Nicotiana tabacum. Leghemoglobin was efficiently imported and correctly processed inside the chloroplasts in transgenic tobacco plants. Furthermore, the maximum level of Lba expression in leaf tissue ranged from 0,01 a 0,1%. Analysis of photosynthesis, metabolite production (sucrose and starch) and enzymes involved in aerobic metabolism in plants cells (catalase [CAT], glutathione reductase [GR] and superoxide dismutase [SOD]) revealed that despite of high affinity of leghemoglobin to oxygen, no difference was observed in relation to contrai plants. These results suggest that higher Lba concentrations must be present inside the organelle in arder to act as an oxygen carrier or facilitate diffusion