Influence of amino acids on growth and morphogenesis of bean (Phaseolus vulgaris L.) leaf tissue in culture

O presente trabalho consta de uma série de experimentos desenvolvidos no Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA/ESALQ/USP). A sua principal finalidade foi a de obter um meio quimicamente definido, para cultura de tecido de feijão (Phaselus vulgaris L.). Sementes de feijão, (Phaselus vulgaris L.) cv. carioca, foram germinadas em areia lavada e mantidas, posteriormente, em nutritiva nº 2 de Hoagland e Arnon. Do primeiro par de folhas das plantas de feijoeiro foram retirados, assépticamente, explantes de aproximadamente 4 x 4 mm e inoculados em meio de cultura. O meio de cultura básico utilizado, foi meio sólido contendo sais minerais, vitaminas e sacarose como fonte energética. Como fatores de crescimento foram fornecidos ao meio cinetina e IAA ou cinetina, IAA, NAA e 2,4-D. O pH dos meios foi acertado para 5,6 após a adição de todos os nutrientes. Aminoácidos isolados ou em grupos foram adicionados ao meio básico para observar a eficiência destas substâncias em promover crescimento de calos e morfogênese de raízes em feijão. Dois meios de cultura considerados como referência foram mantidos. Um deles contendo caseína hidrolisada como fonte de nitrogênio reduzido (meio E): e o outro meio (meio G) contendo apenas o meio básico sem aminoácidos e sem caseína hidrolisada. Durante o desenvolvimento das culturas foram feitas avaliações periódicas do crescimento de calos e desenvolvimento de morfogênese. No final de cada ensaio o peso fresco e o peso seco foram medidos. Com base nos dados obtidos foi calculado o IM (Índice de Morfogênese), o IC (Índice de Crescimento) e os resultados foram submetidos a tratamento estatístico. Pela análise dos resultados observou-se que o meio de cultura que determinou melhor morfogênese foi o meio A contendo o meio básico acrescido de cinetina (1 mg/1), IAA (5 mg/1) e um grupo de três aminoácidos, arginina (60 mg/l), ácido aspártico (50 mg/l) e cisteina (10 mg/l). O meio B constituído de meio básico, acrescido de cinetina (1 mg/l), IAA (5 mg/l) e um grupo de três aminoácidos, ácido glutâmico, (65 mg/l), glicina (25 mg/l) e histidina (10 mg/l) ocasionou uma drástica inibição tanto no crescimento como na morfogênese. Dentre os aminoácidos deste último, o ácido glutâmico revelou-se como sendo a substância que ocasionou a repressão do crescimento. Quando foram testadas dezesseis concentrações de ácido glutâmico, mantendo glicina e histidina constantes, os resultados permitiram concluir que não foi a presença de ácido glutâmico, no meio B, a causa da repressão, mas a concentração usada (65 mg/l). Assim, pode-so observar que concentrações baixas de ácido glutâmico proporcionam um bom crescimento em culturas de tecido de folhas de feijoeiro e que em concentrações elevadas o crescimento decai. O melhor crescimento de calos foi obtido no meio B4 em que o meio básico foi acrescido de quatro hormônios, cinetina (0,2 mg/l), IAA (2 mg/l), NAA (1 mg/l), e 2,4-D (1 mg/l) e um grupo de três aminoácidos, ácido glutâmico (0,5 mg/l), glicina (25 mg/l) e histidina (10 mg/l).This present work consists of a series of experiments developed at C.E.N.A. The main objective of the project being to obtain a chemically defined medium for the tissue culture of bean (Phaseolus vulgaris L.). Beans seeds (Phaseolus vulgaris L.) cv. carioca, were germinated in river sand and maintained, afterwards in Hoagland and Arnons nutrient solution number 2. Explants from the first pair of bean plants were aseptically removed and inoculated on to a modified MURASHIGE and SKOOG (1962) agar culture medium. The medium contained mineral salts, vitamins, and sucrose. The latter was used as the energy source in the basal medium. The growth factors used in the medium consisted of the following: kinetin and IAA together or kinetin, IAA, NAA and 2,4-D. The pH of all media used in these experiments was ajusted to 5.6 aften the addition of all the nutrients. Isolated amino acids or those in groups were added to the basal medium in order to observe the efficiency of these substances in the promotion of callus growth and root morphogenesis. Two kinds of cultures were maintained as standards. One containing hydrolyzed casein as a reduced nitrogen source (medium E) and the other containing basal medium in the absence of amino acids and casein hydrolysate. A periodic scoring of callus growth (fresh and dry weight measurements) and morphogenetic development of the cultures was made at the end of each trial. The IM (Morphogenesis Index) and IG (Growth Index) were calculated from the compiled data and tabulated in a statistical table. According to the results of the analysis, the culture medium that provided optimal morphogenesis was medium A containing basal medium with kinetin (1 mg/l), IAA (5 mg/l) and a group of three amino acids: arginine (60 mg/l), aspartic acid (50 mg/l) and cysteine (10 mg/l). Whereas, the medium B which contained basal medium with kinetin (1 mg/l), IAA (5 mg/l) and a group of three amino acids: glutamic acid (65 mg/l), glycine (25 mg/l) and histidine (10 mg/l), provided a drastic inhibition in both growth and morphogenesis. When 16 glutamic acid concentrates were tested, keeping the glycine and histidine constant, it was observed that the presence of glutamic acid, per se, in medium B that was responsible for growth inhibition but rather the concentration used (65 mg/l). One can conclude, therefore, that at low concentrations of glutamic acid (0.5 mg/l) produced substantial growth however at high concentrations the growth was inhibited. Optimal callus growth was obtained in medium B4, in which four hormones kinetin (0.2 mg/l), IAA (2 mg/l), NAA (1 mg/l) and 2,4-D (1 mg/l) were added to the basal medium together with a group of three amino acids: glutamic acid (0.5 mg/l), glycine (25 mg/l) and histidine (10 mg/l)