Mineral-induced bubbling effect and biomineralization as strategies to create highly porous and bioactive scaffolds for dentin tissue engineering

O objetivo desse estudo foi desenvolver scaffolds porosos de chitosana (CH) contendo diferentes fases minerais, baseados na técnica bubbling effect e submetidos a um protocolo de biomineralização, para criar estratégias biomiméticas para melhorar o potencial odontogênico das células da polpa dentária humana (HDPCs). Suspensões contendo as fases minerais hidróxido de cálcio (Ca), nanohidroxiapatita (nHA) e -Fosfato Tricálcico (TCP) foram adicionadas à solução de CH em uma proporção de 1:2 (v/v). Os scaffolds foram sintetizados pela técnica de separação de fases e biomineralização através da incubação em Simulated Body Fluid (SBF) por 5 dias a 37ºC e sob agitação constante. As amostras foram caracterizadas de acordo com a morfologia, composição química, grau de degradabilidade e capacidade de liberação de cálcio. O comportamento biológico das HDPCs em contato direto e indireto com os scaffolds foi analisado através dos ensaios de viabilidade celular (Live/Dead® e Alamar Blue) e diferenciação odontogênica (atividade de ALP e Alizarin Red). A adição de fases minerais à CH levou ao aparecimento de poros maiores e maiores graus de porosidade, com a complexação de íons cálcio e fosfato à estrutura da quitosana. Os poros dos grupos CH-Ca e CHnHA apresentaram-se redondos, bem distribuídos e com uma rede de poros interconectada. A incubação em SBF foi responsável pela desorganização da estrutura porosa, exceto para a formulação CH-Ca. Deposição dispersa e discreta, semelhante a mineral, foi detectada nos scaffolds de CH e CH-Ca submetidos ao tratamento com SBF, enquanto que maiores depósitos minerais foram observados em CH-nHA e CH-TCP. A deposição de fosfato de cálcio pelo SBF, indicativa de hidroxiapatita, foi confirmada quimicamente pelo FTIR. Os scaffolds contendo fases minerais, incubados ou não em SBF, apresentaram um perfil de degradação controlado, enquanto as formulações com CH pura foram estáveis ao longo dos 28 dias de incubação em PBS. CH-TCP e CH-nHA apresentaram liberação contínua de Ca2+, enquanto que CH-Ca apresentou menor liberação, com pico aos 7 dias. Uma tendência semelhante foi detectada para as contrapartes tratadas com SBF. As células semeadas sobre os scaffolds permaneceram viáveis em todos os períodos de análise. A arquitetura porosa e interconectada dos grupos CH-Ca, CH-nHA e CH-Ca- SBF permitiu que as células infiltrassem e espalhassem através da estrutura do scaffold, enquanto que nas outras formulações as células apresentaram-se dispersas ou aglomeradas. Houve um aumento na viabilidade celular nos grupos contendo fases minerais e biomineralizados comparados ao controle (CH), que foi mais evidente nas amostras tratadas em SBF. Também houve um aumento na diferenciação odontogênica e na deposição de matriz mineralizada nesses grupos comparados aos grupos sem biomineralização, em ambos os modelos experimentais. Um significativo aumento na deposição de matriz mineralizada (de 8.4 a 18.9 vezes) foi observado para CH-Ca-SBF, CH-nHA-SBF e CH- TCP-SBF em comparação à CH pura. Portanto, a biomineralização de scaffolds de quitosana contendo diferentes fases minerais foi responsável por aumentar a capacidade de deposição de matriz mineralizada por células pulpares, com potencial para uso em engenharia tecidual dentináriaThe objective of this study was to develop porous chitosan (CH) scaffolds containing different mineral phases, based on a bubbling effect technique and subjected to a biomineralization protocol, to create biomimetic strategies to improve the odontogenic potential of human dental pulp cells (HDPCs). Suspensions containing the mineral phases calcium hydroxide (Ca), nanohydroxyapatite (nHA), and - tricalcium phosphate (TCP) were added to the CH solution at a 1:2 (v/v) ratio. The scaffolds were synthesized by a phase-separation technique and biomineralized by incubation in Simulated Body Fluid (SBF) for 5 days at 37°C and under constant stirring. The samples were characterized as to their morphology, chemical composition, degree of degradability, and calcium-release capacity. The biological behavior of the HDPCs in direct and indirect contact with the scaffolds was analyzed by cell viability (Live/Dead® and Alamar Blue) and odontogenic differentiation (ALP activity and Alizarin Red) assays. The addition of mineral phases to CH led to the appearance of larger pores and higher degrees of porosity, with complexation of calcium and phosphate ions to the chitosan structure. CH-Ca and CH-nHA pores were round, well-distributed, and with an interconnected network, whereas other formulations had more disorganized architecture. Incubation in SBF was responsible for disorganization of the porous structure, except for CH-Ca formulation. A disperse and slightly mineral-like deposition was detected on CH and CH-Ca scaffolds subjected to SBF treatment, whereas large mineral deposits were observed on CHnHA and CH-TCP. The deposition of calcium phosphate by SBF, indicative of hydroxyapatite, was confirmed chemically by FTIR. The mineral-containing scaffolds, incubated or not in SBF, featured a controlled degradation profile, whereas plain CH formulations were stable throughout 28 days of incubation in phosphate-buffered saline solution. The CH-TCP and CH-nHA showed continuous Ca2+ release, whereas CH-Ca released less Ca2+, with a peak at 7 days. A similar trend was detected for SBFtreated counterparts. The cells seeded onto the scaffolds remained viable at all timepoints. The porous and interconnected porous architecture of CH-Ca, CH-nHA, and CH-Ca-SBF allowed cells to infiltrate and spread throughout the scaffold structure, whereas in other formulations cells were dispersed or agglomerated. There was an increase in cell viability in the groups containing mineral phases and biomineralized compared with the control (CH), which was more evident for SBF-treated samples. There was also an increase in odontogenic differentiation and mineralized matrix deposition in these groups compared with the groups without biomineralization, in both experimental models. A significant increase in mineralized matrix deposition (by 8.4 to 18.9 times) was observed for CH-Ca-SBF, CH-nHA-SBF, and CH-TCP-SBF in comparison with plain CH. Therefore, biomineralization of chitosan scaffolds containing different mineral phases was responsible for increasing the capacity of mineralized matrix deposition by pulpal cells, with potential for use in dentin tissue engineerin