A influência da endometrite subclínica nos preditores precoces de gestão e citocinas pró-inflamatórias nas células imunes circulantes em vacas de leite

In the present study, our objectives were: 1) to evaluate if the expression of ISGs and proinflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) is affected in dairy cows with SCE compared to healthy cows; and 2) to compare the accuracy of early pregnancy predictors (ISGs and US-Doppler) in animals with and without SCE at the begging of FTAI protocol. For this , two experiments were desingned, in the Experiment 1, 30 Holstein cows, in the voluntary waiting period, between 30 and 37 days postpartum, were subbmetted a reproductive examination by transrectal palpation and ultrasonography, and all cows with no sign of uterine disease were included in the study and were subjected to an ovulation synchronization protocol (Co- synch protocol with some modifications). Seven days later (Day 0; day of expected estrus), the occurrence of SCE was diagnosed by counting the proportion of polymorphonuclear cells (PMN) in a uterine cytology sample collected by the Cytobrush technique. On days 0 and 7 (diestrus), tail blood samples were collected for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and determination of gene expression by RT-PCR. After exclusion of some animals, only 12 cows were used for gene expression analysis., being 6 animals with SCE (SCE) and 6 healthy animals (NUD). Experiment 2, 50 Holstein cows that were between 40 and 55 days postpartum were used in order to evaluate the expression of target genes as well as luteal blood perfusion in animals that were diagnosed with SCE at the beginning of the fixed-time artificial insemination (FTAI) protocol. On day -10 (D0, the day of IATF) animals were subjected to a reproductive examination and for those detected without any sign of uterine disease, subjected to the Cytobrush technique as described in Exp 1. On day 21, after the IATF protocol, animals were evaluated by transrectal ultrasonography in color Doppler mode to assess blood perfusion in the corpus luteum and a tail blood sample was collected for PBMCs isolation and gene expression by RT-PCR. On day 32, a confirmatory diagnosis of pregnancy was made by B-mode ultrasonography to identify the presence of a viable embryo with heartbeat. After exclusion and confirmatory diagnosis of pregnancy, they proceeded to gene expression and luteal perfusion analyses. Then, 29 Holstein cows, were allocated to the following groups, 1) healthy and pregnant animals (NUD-P; n=7), 2) with SCE and pregnant (SCE-P; n=4), 3) healthy and non-pregnant (NUD-NP; n=8) and 4) co SCE and non-pregnant (SCE- NP; n=10). Animals with ≥ 5 % of PMN at Exp 1 and ≥ 5.5% at Exp 2 were considered with SCE, and those with ≤ 3% of PMN at Exp 1 and ≤ 2% at Exp 2 were considered without uterine disease (NUD group). The target genes selected for both experiments were ISGs (ISG15, OAS1, MX1 and IFI6) and pro-inflammatory cytokines (IL1-β, TNF- α and IFN-y). ISG15, MX1, IFI6, TNF-α , and IFN- γ expression was not altered from the presence or absence of SCE, time of assessment (Day 0 or 7), or interaction between them (P > 0.1). However, a significant effect was detected on the expression of OAS1 and IL1-β in PBMCs, being greater on Day 7 than Day 0 (P=0.02). In Exp. 2, no significant effect (P > 0.1) of gestational status, occurrence of SCE, or their interaction was observed on the expression of OAS1, MX1, IFI6, and IFN- γ (P > 0.10). However, the abundance of ISG15 and TNF- α showed a significant effect of gestational status being higher in gestating animals compared to nonpregnant animals (P=0.008 and P=0.05, respectively), while the abundance of IL1-β showed a tendency to have a higher expression in gestating animals than nonpregnant animals (P=0.06). For luteal blood perfusion, only a significant effect of gestation (P=0.01) was observed, being higher in gestating animals. In conclusion to the results of Experiment 1, the gene expression of OAS1 and IL1-β are higher during the diestrus period in dairy cows, regardless of the presence of SCE and even in the absence of conception, while the expression of ISG15, MX1, IFI6, TNF- α and IFN- γ are not altered either by the occurrence of SCE or by the moment of the evaluation. Gene expression of ISG15,IL1- β and TNF- α are greater in pregnant cows on D21 after FTAI. The abundance of ISG15 is a good early predictor of pregnancy regardless of the occurrence of SCE, while the abundance of OAS1 and CL blood perfusion are good predictor of pregnancy in cows without SCE. However, the abundance of MX1 and IFI6 were not good predictors at 21 days after FTAI.O desenvolvimento de técnicas capazes de diagnosticar a gestação antes do retorno do estro em vacas leiteiras é essencial para melhorar a eficiência reprodutiva dos sistemas de produção. No presente estudo, nossos objetivos foram: 1) avaliar se a expressão de ISGs e citocinas pró-inflamatórias em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) é afetada em vacas leiteiras com SCE em comparação com vacas saudáveis; e 2) comparar a precisão dos preditores precoces de gestação (ISGs e US-Doppler) em animais com e sem SCE. Para tal, foram realizados dois experimentos, no Experimento 1, 30 vacas holandesas, que estavam no período de espera voluntária, entre 30 e 37 dias pós-parto, foram submetidas a um exame reprodutivo por palpação transretal e ultrassonografia, sendo que todas as vacas que não apresentaram qualquer sinal de doença uterina foram incluídas no estudo e foram submetidas a um protocolo de sincronização da ovulação (protocolo de Co-synch com algumas modificações). Sete dias depois (Dia 0; dia do cio esperado), a ocorrência de SCE foi diagnosticada pela contagem da proporção de células polimorfonucleares (PMN) em uma amostra de citologia uterina coletada pela técnica Cytobrush. Nos Dias 0 e 7 (diestro), foram coletadas amostras de sangue da cauda para isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e determinação da expressão gênica por RT-PCR. Amostras de 6 animais com SCE (SCE) e 6 animais saudáveis (NUD) foram selecionadas para a análise de expressão genica. Já no Experimento 2, foram utilizadas 50 vacas Holandesas, que estavam entre 40 e 55 dias pós-parto, com objetivo de avaliar a expressão dos genes alvos, assim como da perfusão sanguínea luteal em animais que foram diagnosticados com SCE no início do protocolo de inseminação artificial de tempo fixo (IATF). No dia -10 (D0, o dia da IATF) os animais foram submetidos a um exame reprodutivo e para aqueles detectados sem qualquer sinal de doença uterina, submetidos a técnica do Cytobrush como descrito em Experimento 1. No D21 após o protocolo de IATF, os animais foram avaliados por ultrassonografia transretal em modo Doppler colorido para avaliar a perfusão sanguínea no corpo lúteo e uma amostra de sangue da cauda foi coletada para isolamento das PBMCs. No D32, um diagnóstico confirmatório de prenhez foi feito por ultrassonografia modo-B. Animais com ≥ 5 % do PMN no Exp 1 e ≥ 5,5% no Exp 2 foram considerados com SCE, e aqueles com ≤ 3% do PMN no Exp 1 e ≤ 2% na Exp 2 foram considerados sem doenças uterinas (grupo NUD). Assim, no Exp 2, 29 vacas holandesas, foram alocados nos seguintes grupos: animais saudáveis e gestantes (NUD-P; n=7); com SCE e gestantes (SCE-P; n=4); saudáveis e não gestantes (NUD-NP; n=8); e com SCE e não gestantes (SCE-NP; n=10). Foi avaliada a expressão gênica nas PBMCs por RT-PCR de ISGs (ISG15, OAS1, MX1 e IFI6) e citocinas pró-inflamatórias (IL1- β, TNF- α e IFN- γ). No Exp. 1, a expressão ISG15, MX1, IFI6, TNF- α e IFN- γ não foi alterada pela presença de SCE ou momento da avaliação (Dia 0 ou 7; P > 0,1). Entretanto, a expressão de OAS1 e IL1- β nas PBMCs foi maior no dia 7 que no dia 0 (P=0,02). No Exp. 2, nenhum efeito significativo (P > 0,1) do status gestacional, ocorrência da SCE, ou sua interação foi observada na expressão de OAS1, MX1, IFI6 e IFN- γ (P >0,10). A abundância da ISG15, TNF- α e IL1- β foi maior (P=0,008, P=0,05 e P=0,06, respectivamente) nos animais gestantes em comparação aos não gestantes. Para a perfusão sanguínea luteal, apenas um efeito significativo da gestação (P=0,01) foi observado, sendo maior nos animais gestantes. Em conclusão, a expressão de OAS1 e IL1- β é mais elevada durante o diestro em vacas de leite, independentemente da presença da SCE e mesmo na ausência do concepto. Por outro lado, a expressão de ISG15, MX1, IFI6, TNF- α e IFN- γ não sofrem alteração tanto pela ocorrência da SCE ou fase do ciclo estral. A expressão de ISG15, IL1- β e TNF- α no dia 21 pós-IATF é maior em vacas gestantes que não gestantes, independentemente da ocorrência da SCE. A abundância de ISG15 é um bom preditor precoce de gestação, independentemente da ocorrência da SCE. Já a perfusão luteal e a abundância de OAS1, são bons preditores precoces da gestação apenas em vacas sem SCE. A abundância de MX1 e IFI6 não se mostraram bons preditores aos 21 dias após a IATF