Graphene electrical-electrochemical vertical devices: the new generation of on chip biosensors

A pandemia de COVID-19 trouxe a necessidade global de desenvolvimento de novos biossensores de uso prático, com rápida reposta, sensíveis e de baixo custo, visando o diagnóstico no ponto de atendimento e monitoramento em massa da contaminação da população. Nesse sentido, os transistores de efeito de campo de grafeno (GFETs) estão entre os biodispositivos mais promissores devido à sensibilidade e rapidez de resposta. Entretanto, a baixa seletividade, inerente ao mecanismo de resposta dos GFETs e o uso de um eletrodo de referência não-polarizável do tipo Ag/AgClsat em sua configuração limitam a aplicação. Neste sentido, nesta Tese de Doutorado apresentam-se o desenvolvimento e a aplicação de um novo tipo de biossensor a base de grafeno monocamada, com detecção híbrida, onde o dispositivo usa princípios elétricos e eletroquímicos, denominado Dispositivo Elétrico-Eletroquímico Vertical de Grafeno (DEEV). O DEEV foi projetado para que um eletrodo formado pela heterojunção de camada grafeno/sonda redox adsorvida fique exposta ao eletrólito e, com isso, pequenas mudanças causadas por analitos na interface eletrodo/eletrólito altere a densidade de carga próxima ao ponto K da primeira zona de Brillouin do grafeno. Esta perturbação altera o ponto de Dirac e causa dispersão de energia, resultando em diferentes valores de capacitância e potencial da interface, que são fortemente correlacionadas à presença do analito. Além disso, foi observado que processos faradaicos podem ocorrer no plano ortonormal do grafeno na presença de uma sonda redox acoplada por interações de van der Waals, intensificando a perturbação da interface pela presença do analito no eletrólito, tornando o DEEV mais sensível quando comparado ao GFET. Como prova de conceito, utilizou-se um DEEV baseado na heterojunção grafeno/ferroceno para detecção de DNA em fita única, obtendo-se um limite de detecção (LOD) na ordem de zeptomolar (10-21 mol L-1). Por ter carga total negativa, o DNA altera a capacitância da interface formada pela heterojunção, alterando também o potencial de circuito aberto (OCP), que por sua vez, responde às mudanças de concentrações de DNA. Por conseguinte, o DEEV foi aplicado como um imunossensor para diagnóstico de COVID-19. Para isso, substituiu-se o ferroceno pela sonda redox neutral red modificada com os domínios RBD da proteína Spike do SARS-CoV-2. Nesta configuração, o biossensor requer 40 µL de amostra de soro de um paciente infectado com COVID-19, sendo possível detectar anticorpos IgG produzidos em resposta à infecção por COVID-19 com LOD de 1,0 pg mL-1. Por fim, desenvolveu-se um biossensor do tipo DEEV para detecção de antígeno (vírus SARS-CoV-2) em amostras de saliva, com LOD de 2,86 fmol L-1, indicando a adequação do biossensor para o diagnóstico de COVID-19 em estágio inicial. Tanto o imunossensor, quanto o biossensor de antígeno para diagnóstico de COVID-19, foram validados em amostras reais e utilizando parâmetros de validação da ANVISA e ABRAMED.The COVID-19 pandemic brought the global need to develop new biosensors for practical use, with quick response, sensitivity, and low cost, aiming point-of-care diagnosis and mass monitoring concerning the contamination of a population. In this sense, graphene field effect transistors (GFETs) are among the most promising biodevices due to their sensitivity and rapidness of response. However, the low selectivity inherent to the response mechanism of GFETs and the use of a non-polarizable reference electrode of the Ag/AgClsat type in its configuration limit its application. In this sense, this Doctorate Thesis presents the development and application of a new type of biosensor based on monolayer graphene, with hybrid detection, where the device uses electrical and electrochemical principles, called Graphene Vertical Electrical-Electrochemical Device (EEVD). EEVD was designed so that an electrode formed by the heterojunction of a graphene layer/adsorbed redox probe is exposed to the electrolyte and, as a result, small variations caused by the presence of analytes at the electrode/electrolyte interface change the charge density near the graphene K point of first Brillouin zone. This perturbation alters the Dirac point and causes energy dispersion, resulting in different values of capacitance and potential of the interface, which are strongly correlated to the presence of the analyte. Furthermore, it was observed that faradaic processes can occur in the orthonormal plane of graphene in the presence of a redox probe coupled by van der Waals interactions, intensifying the interface perturbation by the presence of the analyte in the electrolyte, making EEVD more sensitive when compared to GFET. As a proof of concept, a EEVD based on the graphene/ferrocene heterojunction was used for single-stranded DNA detection, obtaining a limit of detection (LOD) of zeptomolar magnitude order (10-21 mol L-1). Because it has a total negative charge, DNA changes the capacitance of the interface formed by the heterojunction, and varies its open circuit potential (OCP), which in turn responds linearly to alterations of DNA concentrations. Therefore, EEVD was applied as an immunosensor for the diagnosis of COVID-19. For this, ferrocene was replaced by the neutral red redox probe modified with Spike protein receptor binding domain (RBD) of SARS-CoV-2. In this configuration, the biosensor requires 40 µL of serum sample from a patient infected with COVID-19, and it is possible to detect IgG antibodies produced in response to COVID-19 infection with an LOD of 1.0 pg mL-1. Finally, an EEVD-type biosensor was developed for antigen detection (SARS-CoV-2 virus) in saliva samples, with a LOD of 2.86 fmol L-1, indicating the suitability of the biosensor for the diagnosis of COVID-19 in early stage. Both the immunosensor and the antigen biosensor for the diagnosis of COVID-19 were validated in real samples and using validation parameters from ANVISA and ABRAMED