Validation of the ex vivo model of human skin (hOSEC) for pharmaceutical ingredient absorption assay

Métodos alternativos ao uso de animais vêm sendo estudados e desenvolvidos ao longo dos anos, merecendo destaque a cultura de explante de pele organotípica humana (hOSEC). Considerada o modelo que mais se aproxima da pele humana em condições in vitro, apresenta estrutura 3D e todas as células da pele nativa, sendo um modelo versátil para o estudo de várias doenças e testes de novos fármacos. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi validar o modelo ex vivo de pele humana (hOSEC) para ensaio de absorção de insumos farmacêuticos. Foram utilizados os fármacos Dacarbazina e Rifampicina. A viabilidade celular para ambos os fármacos foi testada pelo ensaio MTT em queratinócitos e fibroblastos primários e em linhagens imortalizadas da pele (HaCaT e 3T3). Também foi testada a sensibilidade de linhagens de melanoma humano A375, 1205 Lu e SK-MEL-103 tratadas com Dacarbazina nos tempos de 24, 48 e 72 horas. A viabilidade tecidual do modelo hOSEC tratado com os fármacos foi avaliada pelo método TTC nos tempos de 24, 48, 72 e 96 horas. A Dacarbazina e o modelo hOSEC foram validados por meio de cromatografia líquida de alta eficiência e, seguida à validação, a absorção do fármaco pelo tecido nos tempos de 30 minutos, 1, 3, 6, 12 e 24 horas foi analisada também por cromatografia. A estrutura da pele e apoptose pós-tratamento com Dacarbazina foram analisados por histologia corada com hematoxilina e eosina e TUNEL, respectivamente. Foi realizada a inoculação da linhagem A375 no modelo hOSEC e avaliada o local de aplicação e características das células por meio da coloração hematoxilina e eosina. Os testes de viabilidade frente à Dacarbazina mostraram que tanto nas células primárias quanto nas imortalizadas da pele foram consideradas viáveis (acima de 77%). Em relação as linhagens neoplásicas, a A375 foi a que se mostrou mais sensível em todas as concentrações, principalmente no tempo de 72 horas, diferentemente da 1205 Lu e SK-MEL-103, que se mostraram mais resistentes. Já utilizando a Rifampicina, foi observado uma sensibilidade maior quando exposta à concentração de 200 µg/mL nas quatro diferentes células estudadas. A validação do método foi linear, preciso e exato, demonstrando uma alta confiança para sua utilização. Em relação a absorção da Dacarbazina pela pele, foi observado que a concentração do fármaco na pele foi aumentando e consequentemente diminuindo no meio de cultura até 24 horas, atingindo concentração máxima pela pele de 36,36 µg/mL (18,18%) da dose inicial de 200 µg/mL no tempo de 12 horas. Dados histológicos mostraram que as camadas da pele foram mantidas estruturalmente em todos os tempos estudados. Não foram observadas células apoptóticas nas camadas epidérmica e dérmica. A inoculação das células A375 foi realizada de maneira adequada, intradermicamente, e as características de células neoplásicas foram mantidas. Portanto, nossos resultados confirmam que o modelo hOSEC pode ser um modelo alternativo para avaliar a dinâmica de absorção e distribuição de insumos farmacêuticos na pele, assim como também pode ser possível obter um modelo ex vivo de tumor na pele a partir da inoculação de células neoplásicas.Alternative methods to the use of animals have been studied and developed over the years, with emphasis on the human organotypic skin explant culture (hOSEC). Considered the closest model to human skin under in vitro conditions, it has a 3D structure and all native skin cells, making it a versatile model for the study of various diseases and testing of new drugs. In this context, the aim of this work was to validate the ex vivo model of human skin (hOSEC) for pharmaceutical ingredient absorption assay. The drugs Dacarbazine and Rifampicin were used. Cell viability for both drugs was tested by MTT assay in primary keratinocytes and fibroblasts and in immortalized skin cell lines (HaCaT and 3T3). The sensitivity of human melanoma cell lines A375, 1205 Lu and SK-MEL-103 treated with Dacarbazine was also tested at times of 24, 48 and 72 hours. Tissue viability of the drug-treated hOSEC model was evaluated by the TTC method at times of 24, 48, 72 and 96 hours. Dacarbazine and the hOSEC model were validated using high-performance liquid chromatography and, after validation, the drug absorption by the tissue at times of 30 minutes, 1, 3, 6, 12 and 24 hours was also analyzed by chromatography. Skin structure and apoptosis after treatment with Dacarbazine were analyzed by histology stained with hematoxylin and eosin and TUNEL, respectively. Inoculation of the A375 cell in the hOSEC model was performed and the application site and cell characteristics were evaluated by hematoxylin and eosin staining. Viability tests in relation to Dacarbazine showed that both primary and immortalized skin cells were considered viable (above 77%). Regarding neoplastic cell lines, A375 was the most sensitive at all concentrations, especially at 72 hours, unlike 1205 Lu and SK-MEL-103, which were more resistant. With the use of Rifampicin, a greater sensitivity was observed when exposed to a concentration of 200 µg/mL in the four different cell lines studied. The method validation was linear, precise and exact, demonstrating a high confidence for its use. Regarding the absorption of Dacarbazine through the skin, it was observed that the drug concentration in the skin increased and consequently decreased in the culture medium for up to 24 hours, reaching a maximum concentration through the skin of 36.36 µg/mL (18.18%) of the initial dose of 200 µg/ml in 12 hours. Histological data showed that the skin layers were structurally maintained at all times studied. Apoptotic cells were not observed in the epidermal and dermal layers. Inoculation of A375 cells was adequately performed, intradermally, and the characteristics of neoplastic cells were maintained. Therefore, our results confirm that the hOSEC model may be an alternative model to assess the dynamics of absorption and distribution of pharmaceutical ingredients in the skin, as well as it may also be possible to obtain an ex vivo model of tumor of the skin from the inoculation of neoplastic cells