Study of genes\' expression involved in the NF-kB pathway in late-onset neonatal sepsis: potential value in diagnosis and prognosis

Os avanços na terapia intensiva neonatal proporcionaram uma melhora na sobrevida dos pacientes, entretanto a sepse ainda constitui uma das principais causas de mortalidade em recém-nascidos (RN). Até o momento, nenhum marcador biológico único apresentou vantagem significativa sobre outros para o diagnóstico da sepse neonatal. Deste modo, a disponibilização de um painel de biomarcadores gênicos, que possa diferenciar mais precocemente RN infectados dos não infectados e, ainda, identificar diferentes padrões de resposta causados por agentes etiológicos distintos, pode ter impacto significativo na morbimortalidade da sepse neonatal, contribuindo para a redução dos custos hospitalares e, ainda, diferenciar um bom ou mau prognóstico. O objetivo desse estudo é descrever a expressão de genes relacionados com a via de sinalização do fator nuclear Kappa B (NF-kB) em RN com sepse tardia clínica e comprovadamente causada por bactérias Gram-positivas (G+) e Gram-negativas (G-), em três momentos diferentes: no dia do diagnóstico (dia 0), e após 3 e 7 dias de antibioticoterapia. Foram coletadas 32 amostras de sangue de RN distribuídas em grupos de acordo com o agente etiológico: com sepse causada por bactérias G+ (n = 12); causada por bactérias G- (n = 9); RN com sepse clínica (n = 11). O grupo controle foi composto por 21 amostras de RN sem sinais de infecção. A expressão gênica foi avaliada utilizando-se a metodologia RNA-Seq por meio de sequenciamento paralelo em larga escala de um painel de genes relacionados à via de sinalização do NF-kB, utilizando o kit TruSeq Targeted RNA Custom (Illumina Inc., San Diego, CA, USA), na plataforma Illumina MiSeq. Na análise, os fragmentos foram alinhados à referência hg38 do genoma humano utilizando o software STAR (PMID: 23104886). Para a normalização e análise da expressão diferencial, foi utilizado o software DESeq2 (PMID: 25516281). A avaliação do perfil de expressão gênica revelou 11 genes diferencialmente expressos (DEG) no grupo de sepse por G+, 22 genes no grupo G- e 12 genes no grupo de sepse clínica em relação aos controles. Os termos de ontologia gênica (GO) significantemente enriquecidos para esses genes estão associados à atividade de citocinas e ligação aos seus receptores, regulação da via de sinalização do NF-B e lúmen do grânulo terciário. Em todos os grupos de sepse observamos a hiperexpressão do gene MMP9 e a hipoexpressão do CXCL2 e somente nos grupos de sepse comprovada por bactérias G+ e G-, a hiperexpressão do gene MBL2. No grupo G+, o gene MMP9 apresentou hipoexpressão no dia 0 comparado aos dias 3 e 7 e IL12B apresentou hipoexpressão no dia 0 em relação ao dia 7. No grupo G-, foi obervada a hiperexpressão do gene TREM1 no dia 0 comparado aos dias 3 e 7 e também a hipoexpressão do IL12B no dia 0 em relação ao dia 7. No grupo de sepse clinica, foi observada hiperexpressão do gene IRF1 no dia 0 comparado ao dia 3 e hipoexpressão do FOXP3 no dia 3 comparado ao dia 7 pós-diagnóstico. Os DEG MMP9, MBL2, IL-12B, ESM1 e TREM1 foram selecionados e validados funcionalmente por meio da quantificação da proteína por ensaio imunoenzimático. Os resultados revelaram que os genes MMP9 e MBL2 são importantes para identificação dos casos de sepse comprovada e no grupo de sepse clínica, foi observado um perfil de expressão diferente, sem alteração na expressão do gene MBL2, porém com hiperexpressão do IRF1, sugerindo uma possível infecção viral ou bacteriana não identificada. O gene TREM1 constitui um possível preditor de mau prognóstico para a sepse neonatal tardia. Os genes diferencialmente expressos MMP9, MBL2 e TREM1 codificam proteínas importantes, comprovadamente envolvidas na patogênese da sepse neonatal e apresentam potencial para serem utilizados como biomarcadores gênicosThe advances in neonatal intensive care provided an improvement in patient survival, however sepsis still constitutes one of the main causes of mortality in the newborn (NB). So far, no single biological marker showed significant advantage over others for the diagnosis of neonatal sepsis. Thus, the availability of a panel of gene biomarkers, which could differentiate infected from non-infected NBs earlier and, which could also identify different response patterns caused by different etiologic agents, can have a significant impact on the morbidity and mortality of neonatal sepsis, contributing to the reduction of hospital costs and, also, differentiate a good or poor prognosis. The aim of this study is to describe gene expression related to the nuclear factor-Kappa B (NF-kB) signaling pathway in NBs with clinical and culture-proven late-onset sepsis caused by Gram-positive (G+) and Gram-negative (G-) bacteria, at three different moments: on the day of diagnosis (day 0), and after 3 and 7 days of antibiotic therapy. Thirty-two blood samples were collected from NBs distributed in groups according to the etiologic agent: sepsis caused by G+ bacteria (n = 12); caused by G- bacteria (n = 9); NBs with clinical sepsis (n = 11). The control group was composed of 21 NB samples without signs of infection. Gene expression was evaluated using the RNA-seq methodology through large-scale parallel sequencing of a gene panel related to the NF-B signaling pathway, using the TruSeq Targeted RNA Custom Kit (Illumina Inc., San Diego, CA, USA), on the Illumina MiSeq platform. In the analysis, the fragments were aligned to the hg38 reference of human genome using the STAR software (PMID: 23104886). For normalization and analysis of differential expression, the DESeq2 software (PMID: 25516281) was used. The evaluation of the gene expression profile revealed 11 differentially expressed genes (DEG) in the G+ sepsis group, 22 genes in the G- group and 12 DEG genes in the clinical sepsis group compared to controls. The terms of gene ontology (GO) significantly enriched for these genes are associated to cytokine activity and binding to its receptors, regulation of the NF-kB signaling pathway and tertiary granule lumen. In all sepsis groups, we observed MMP9 gene up-regulation and CXCL2 down-regulation and solely in the culture-proven G+ and G- groups, the up-regulation of MBL2, as compared to controls. In the G+ group, MMP9 gene was down-regulated on day 0 as compared to days 3 and 7 and IL12B was down-regulated on day 0 relative to day 7. In G- group, TREM1 gene was up-regulated on day 0 compared to days 3 and 7 and IL12B was also down-regulated on day 0 relative to day 7. In the clinical sepsis group, up-regulation of IRF1 gene was observed on day 0 compared to day 3 and down-regulation of FOXP3 on day 3 compared to day 7 post-diagnosis. The DEG MMP9, MBL2, IL-12B, ESM1 and TREM1 were selected and functionally validated by protein quantification by immunoenzymatic assay. The results revealed that MMP9 and MBL2 genes are important for the identification of culture-proven sepsis cases and in the clinical sepsis group, a different expression profile was observed, without alteration in the MBL2 gene expression, however with IRF1 over expression, suggesting a possible unidentified viral or bacterial infection. TREM1 gene is a possible predictor of poor outcome for late neonatal sepsis. The differentially expressed genes MMP9, MBL2 and TREM1 encode important proteins, proven to be involved in the pathogenesis of neonatal sepsis and have the potential to be used as gene biomarker