Morphologic, molecular and immunomatrix profile applicability at signaling therapeutic targets in malignant mesothelioma

INTRODUÇÃO: O mesotelioma maligno (MM) é uma neoplasia maligna altamente letal e associada à exposição às fibras do amianto. Os modelos preditivos e prognósticos levam em consideração os tipos histológicos (epitelioide vs sarcomatoide) e o estadiamento clínico. Além da falta de modelos histopatológicos matemáticos, pouco se conhece sobre o papel da matriz extracelular (MEC) e da presença de outros alvos terapêuticos, como a resposta imunocelular. Nessa tese, sugerimos um modelo prognóstico com base nas características histopatológicas e imunomatriciais e identificamos um novo potencial biomarcador diagnóstico e prognóstico. MÉTODOS: Foram construídos microarranjos teciduais (TMAs) a partir de amostras parafinadas de MM (epitelioide e sarcomatoide), de carcinomas de mama e de pulmão. Foram avaliados parâmetros morfológicos (celularidade tumoral, grau nuclear e linfócitos intratumorais, TILs), imuno-histoquímicos (IHQ), como BAP-1, Ki-67, P53, D2-40, MLH1, PMS2, MSH2, MSH6, PD-1, PD-L1, CD30, CD4, CD8, CD20, CD68, Vimentina, E-Caderina e imunofluorescência (IF) para Colágeno V (Col (V). A matriz extracelular (MEC) fibrilar foi caracterizada para fibras grossas e finas do colágeno (Picrosírius), fibras elásticas (Resorcina) e fibras do colágeno (Imunofluorescência) tipos I, III, IV e V. A MEC não-fibrilar foi avaliada para o ácido hialurônico através do Pentacromio de Movat. Apoptose em células malignas (CMs) foi estimada através da técnica do TUNEL. As lâminas contendo os TMAs foram digitalizadas por métodos computacionais para avaliação e quantificação dos marcadores. Os parâmetros obtidos foram clusterizados em modelo semi-assistido segundo relevâncias biológica e da regressão logística, com desfecho em sobrevida. Finalmente, o padrão de imunossupressão do Col (V) foi comparado entre as células malignas (CMs) dos MM, carcinomas de mama e pulmão e correlacionado aos demais marcadores e sobrevida. RESULTADOS: (I) Caracterização da coorte: A coorte foi composta por 82 pacientes, sendo 73 (89%) portadores de MM epitelioide e 9 (11%) MM sarcomatoide. A densidade de TILs foi correlacionada à densidade de CMs PD-L1 positivas (p = 0,01) e linfócitos T CD8 positivos (p=0,005) em 69% (57/82) dos MM. Todos MM apresentaram fenótipo de transição epitélio mesenquimal (Vimentina positivo e perda de expressão de E-caderina), sendo que a MEC fibrilar e não-fibrilar dos tipos epitelioide e sarcomatoide apresentou composição diferente (densidade de ácido hialurônico de 6,57 vs 10,73, p < 0,05, elastina 6,08 vs 2,03, p < 0,05, colágeno total de 12,05 vs 32,71, p < 0,05, colágeno I de 1,10 vs 0,16, p < 0,05 e fibrina de 4,14 vs 1,02, p < 0,05 na comparação entre epitelioides e sarcomatoides, em fibras/mm3 ). Isoladamente, a baixa expressão de PMS2 (58,44% vs 29,14% no grupo óbito com p<0,001) foi correlacionada à ao risco de óbito (R=1,20). (II) Modelo preditivo: A análise de cluster hierárquico estratificou dois grupos de pacientes com o desfecho óbito. O cluster de alto risco demonstrou alta densidade de fibras de Col (V), baixa densidade de linfócitos T CD8+ e alta celularidade tumoral, independentes das demais características histopatológicas (p < 0,01, com razão de risco de 2,19 (0,54-3,03). (III) Colágeno V: O Col (V) foi colocalizado ao D2-40 (p<0,05; R=0,95), com padrão de expressão por IF individualizando CMs em 95% dos MM e 0% dos carcinomas de mama e pulmão; padrão em blocos CMs em 5% dos MM, 9,3% dos carcinomas de pulmão e 98,9% de mama (p<0,05) e padrão misto (individual e blocos de CMs) em 0% MM, 7,7% carcinomas de pulmão e 1,2% de mama; A IF do Col (V) revelou predominância da expressão individualizada de CMs nos MM (75,6%) em comparação a 7,3% e 17,1% dos carcinomas de pulmão e mama (p < 0,001) e baixa expressão do padrão em blocos celulares (3,7% MM vs 35,2% pulmão e 61% mama, p<0,001). A intensidade de expressão também foi mais intensa nos MM (H-Score mediano de 100 para MM vs 47 em carcinomas de pulmão e 60,6 em mama; p=0,047 e p=0,024 entre os respectivos grupos). A especificidade da IHQ em padrão de células isoladas para Col (V) foi de 0,901, com sensibilidade do padrão em blocos para carcinomas de 0,961. O padrão de expressão do Col (V) mostrou-se preditivo da sobrevida livre de doença quando expresso no padrão CMs isoladas em comparação a blocos (p = 0,05; R = 0,69). A igualdade distribuição dos padrões entre a IF e IHQ foi observada somente no grupo de blocos CMs (p = 0,054). CONCLUSÕES: A necessidade de conhecimento de potenciais alvos terapêuticos para o MM é irrefutável em vista de poucas opções terapêuticas, assim como a caracterização da MEC para melhor compreensão da biologia tumoral. Construímos um modelo de fluxo de trabalho de extração de dados histopatológicos com uso de técnicas de patologia computacional acessíveis, integramos os dados em um modelo prognóstico com utilidade clínica. Finalmente, descrevemos um biomarcador da MEC, não descrito previamente, o Col (V), como promissor marcador preditivo de diagnóstico e prognóstico do MM na rotina clínica da patologia cirúrgica.INTRODUCTION: Malignant mesothelioma (MM) is a highly lethal malignancy associated with exposure to asbestos fibers. Prognostic models take into account histological type (epithelioid vs sarcomatoid) and clinical staging, while biomarkers are often neglected. Current therapeutic targets, as PD-L1, are incipiently reported, as well as little is known about the extracellular matrix (ECM). In this thesis, we suggest a mathematical prognostic model based on histopathological features extracted through computational pathology, characterize ECM and describe a new diagnostic and prognostic biomarker with potential practical use in surgical pathology. METHODS: Tissue microarrays were built from paraffin-embedded MM (epithelioid and sarcomatoid), breast and lung cancer blocks. We evaluated morphological (nuclear grade and intratumoral lymphocytes, TILs) and immunohistochemical (IHC) parameters such as BAP-1, Ki-67, P53, MLH1, PMS2, MSH2, PD-1, PD-L1, CD30, CD4, CD8, CD20, CD68, Vimentin, E-Cadherin and Collagen V (Col (V)). Fibrillary ECM was characterized by histochemical stains (Picrosirius for thick and thin collagen fibers), Resorcin (elastic fibers) and IF for collagen types I, III, IV and V. Non-fibrillar fibers were evaluated by Movat Pentachrome for hyaluronic acid. Apoptosis was estimated using the Tunel technique. Histology slides were digitalized for the evaluation and quantification of the markers, through computational technique. Data was clustered through semi-assisted model according to biological and logistic regression relevance, targeted at survival outcome. In addition, Col (V) immunoexpression pattern was compared between MM and breast and lung tumors and correlated with other markers and survival. RESULTS: (I) Cohort characterization: The MM cohort consisted of 82 patients, 73 (89%) epithelioid type and 9 (11%) sarcomatoid; Of the prognostic markers, the expression of TILs was correlated to tumor cells expression of PD-L1 (p = 0.01) and CD8 (p = 0.005). All cases are of EMT phenotype (vimentin positive with loss of expression of e-caderina) and the ECM compositions of the epithelioid and sarcomatoid types was distinct (hyaluronic acid density of 6.57 vs 10.73, p<0.05, elastin 6.08 vs 2,03, p < 0.05, total collagen 12,05 vs 32.71, p < 0.05, type I collagen 1.10 vs 0.16, p < 0.05 and fibrin 4.14 vs 1.02, p < 0.05 epithelioid vs sarcomatoid, fibers/mm3 ). Also, low PMS2 expression (58.44% vs 29.14% dead of disease group p<0.001) was isolated correlated with poor survival (R = 1.20). (II) Hierarchical cluster analysis stratified into two groups of patients with the death outcome. The high-risk cluster showed high density of Col (V) fibers, low density of CD8 + T lymphocytes and high cellularity, independent of the other histopathological characteristics (p <0 .01, HR 2.19 (0.54-3.03). (III) Collagen V: Col (V) was colocalized with D2-40 (p = 0.95, Spearman). IF Col (V) expression was evidenced in patterns of individualized cells, blocks and mixed pattern. The pattern of individualized cells was evidenced in 95% of MM cases and 0% in other tumors, mixed pattern in 0% MM, 7.7% lung and 1.2% breast and cell block pattern in 5% of MM, 9.3% lung and 98.9% breast (p<0,001). Col (V) IHC revealed predominance of expression of isolated cell pattern in MM (75.6%) compared to 7.3% and 17.1% in lung and breast (p <0.001), as well as low expression of cell blocks pattern (3.7% MM vs 35.2% lung and 61% breast, p