Molecular characterization of yellow fever virus from 2018-2019 outbreak in São Paulo

A febre amarela é uma febre hemorrágica, viral e endêmica de regiões tropicais na América Central e do Sul e no continente Africano, afetando principalmente humanos e primatas não-humanos, causada pelo vírus da Febre Amarela (YFV). O recente surto de Febre amarela no Brasil foi um dos mais graves nos tempos atuais disseminando-se para áreas com baixa cobertura vacinal. Durante os picos dos surtos, foi possível observar uma diferença na evolução clínica dos pacientes que trouxe o questionamento se o vírus poderia ter apresentado mutações que levassem a uma alteração no quadro clínico. O presente estudo avaliou a diversidade genética do vírus da Febre Amarela dos casos internados no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de São Paulo, que sobreviveram à infecção durante o surto ocorrido em São Paulo nos anos de 2018 e 2019 e determinou a carga viral bem como o genótipo da cepa viral circulante. Para a realização deste estudo foram utilizadas amostras de soro e/ou urina positivas para o vírus da Febre Amarela, que foram submetidas à extração do RNA viral e em seguida à amplificação de cDNA. O sequenciamento de nova geração foi realizado e posteriormente feita a análise de dados utilizando ferramentas de bioinformática próprias para gerar as informações sobre a qualidade e cobertura das sequências a fim de realizar a montagem do genoma viral, análises das variantes e análises filogenéticas. Utilizando essa estratégia, foram obtidos 39 genomas quase completos, sendo possível a análise da diversidade genética viral entre os grupos de 2018 e 2019. Foram encontradas 46 substituições nucleotídicas (nt), sendo 20 delas substituições não sinônimas, com destaque para as posições 195 nt (presente em 60% das amostras de 2019) e 218 nt no capsídeo (presente em 28,6% das amostras de 2018), 5055 nt na NS3 presente em 100% das amostras deste estudo e 10.104 nt na NS5 (42,85% de 2018 e 96% de 2019), proteína polimerase do vírus. A única substituição nucleotídica encontrada neste estudo previamente publicada foi na posição 5055 nt da proteína NS3. Analisando as árvores filogenéticas, os genomas foram classificados como genótipo Sul Americano I subgrupo E, sendo este resultado comparado com estudos previamente publicados e de acordo com o descrito. É possível observar que 85,7% da casuística deste estudo é composta por pacientes do sexo masculino. Mapeamentos geográficos do provável local de infecção dos pacientes incluídos no estudo, demonstraram que o surto de 2018 teve uma maior concentração na região da Grande São Paulo, chegando ao litoral paulista, e o surto de 2019 concentrou-se, em sua maior parte, no Vale do Ribeira. Este estudo sugere que os vírus circulantes nos surtos de 2018 e 2019 são distintos, porém para um melhor entendimento do impacto das variantes sobre a patogênese viral, é necessária uma análise in silico. Em geral, as análises aqui realizadas permitem um melhor entendimento do genoma do YFV circulante em São Paulo e contribui para futuros estudos virológicos e epidemiológicosYellow fever is a viral and endemic hemorrhagic fever from tropical regions in the Central and South Americas and Africa, affecting mainly humans and nonhuman primates, caused by the Yellow Fever virus (YFV). The recent outbreak of yellow fever in Brazil has been one of the most severe in the last decades, spreading to areas with low vaccine coverage. During the peak of the 2018-2019 outbreak, it was possible to observe a difference in the clinical evolution of the patients and it raised questions of whether the virus could have had mutations that led to milder clinical symptoms. The present study aimed to evaluate the genetic diversity of Yellow fever virus of Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina de Sao Paulo, hospitalized cases that survived the infection during the recent outbreak, in order to determine the viral load and genotype of the circulating viral strain in Sao Paulo. YFV-positive serum and / or urine samples were subjected to viral RNA extraction and then cDNA amplification. New generation sequencing and data analyses were carried out using bioinformatics tools for quality and coverage analysis for genome assembly, variant and phylogenetic analyses. Almost thirty-nine nearly complete YFV genomes were obtained and genetic diversity analysis comparing the circulating virus strains during 2018 and 2019, allowed us to find 46 nucleotides (nt) substitutions, and 21 of them were non-synonymous substitutions, highlighting the positions 195nt (60% of samples from 2019) and 218nt (28.6% of samples from 2018) in capsid protein, 5055nt (100% of samples) in NS3 protein and 10.104 in NS5 protein (42.85% of samples from 2018 and 96% samples from 2019). Phylogenetic analysis demonstrated that all YFV strains circulating during the outbreak form a unique major clade with the South American IE genotype. This finding was compared with previously published studies and is in accordance with what has been described so far. In conclusion, it was possible to describe that 85.7% of all patients enrolled in this study are male and the peak from 2018 YFV outbreak was concentrated in Greater Sao Paulo, going to the coast but the peak from 2019 outbreak was more concentrated in Vale do Ribeira. Our findings suggest that 2018 and 2019 circulating viruses were distinct from each other however for a better understanding of how these variants affect the viral pathogenesis it is necessary to perform an in silico analysis. Overall, our findings provide an overview of YFV genome characterization in Sao Paulo and contribute for future virological and epidemiological studie