Effect of mutations in TrkA gene found in insensitivity to congenital pain on cell signaling pathways

A insensibilidade congênita à dor e anidrose (CIPA), uma desordem genética autossômica recessiva, é caracterizada por episódios recorrentes de febre inexplicável, anidrose, retardo mental e principalmente pela falta de percepção da dor sensorial, devido à ausência de fibras sensitivas primárias dependentes de NGF e de neurônios simpáticos pós ganglionares. Mutações que causam perda de função do receptor de tropomiosina quinase A (TrkA) estão entre os principais fatores que levam à doença. O TrkA é um receptor de alta afinidade pelo NGF, e a formação do complexo NGF/TrkA tem papel no desenvolvimento neuronal, bem como na sensibilização para percepção de aumento de temperatura e de estímulo mecânico, que resulta em hiperalgesia. Muitas mutações compõem o espectro da síndrome da CIPA, entre elas, as localizadas no domínio quinase do TrkA são o alvo desse estudo, pois estas podem alterar o funcionamento da quinase e, assim, interferir em importantes vias de sinalização celular (PLCγ, Akt e ERK). Com o objetivo de compreender como as vias de sinalização são alteradas pelas mutações em TrkA na CIPA, através da análise de artigos publicados no PubMed, identificamos 131 mutações diferentes neste gene. As mutações missense foram localizadas na estrutura tridimensional e classificadas em três classes (1) mutações próximas ao local de ligação da ATP (sítio catalítico), (2) mutações no local de ligação ao substrato (SBS) e (3) mutações em outras regiões estruturadas do TrkA que poderiam impedir o enovelamento correto da proteína. Validamos in vitro uma das mutações de CIPA (R654C), classificada tanto como mutação no sítio deligação de ATP quanto na região de SBS. Como previsto nas modelagens, essa mutação apresentou inativação total da TrkA. As mutações nonsense e frameshift também afetariam significativamente a estrutura da TrkA, porém, embora algumas delas como Q770*, Q782*, V777Cfs*91 e L784Sfs*79, fariam com que uma proteína truncada fosse expressa afetando especificamente a ancoragem de PLCγ sua presença desencadeou o fenótipo de CIPA nos pacientes, indicando que a ativação de PLCγ seria uma importante via para a ocorrência da dor. Baseado nestes achados, foi desenvolvido um peptídeo que inibe a interação do TrkA e PLCγ, denominado QYP. Em células HEK 293 transfectadas com TrkA, QYP foi capaz inibir a ativação de PLCγ mediada por NGF. Ainda, em ensaios comportamentais in vivo de dor inflamatória aguda e crônica induzida por CFA, QYP foi capaz de inibir a hipersensibilidade mecânica e parcialmente a térmica causada pela inflamação por até 6 horas. QYP também se mostrou mais eficiente que inibidores comerciais (GNF,inibidor de TrkA e U73347,inibidor de PLC) na reversão da sensibilidade dolorosa. Com base nos nossos resultados, validamos que a via de PLCγ é essencial para o desenvolvimento de dor mecânica, sendo essa via um alvo em potencial para o desenvolvimento de novos analgésicos. Ainda, o peptídeo QYP mostrou-se efetivo na reversão da sensibilidade dolorosa aguda e crônica em modelos in vivo de dor inflamatória.Mutations that cause loss of function of the tropomyosin kinase A receptor (TrkA) are among the main factors that lead to the disease. TrkA is a high affinity receptor for NGF, and the formation of the NGF / TrkA complex plays a role in neuronal development, as well as in sensitization to perceived temperature increases and mechanical stimulation, which results in hyperalgesia. Many mutations compose the syndrome spectrum of CIPA, amongst them the ones found in the kinase domain are object of the present study, because they can alter this domain\'s activity and thus interfere in important signaling pathways mediated by TrkA (PLCγ, Akt, and ERK). With the objective of understanding how signaling pathways are altered by the mutations in CIPA, we searched several published articles on PubMed and identified the description of more than 131 mutations in this gene. Missense mutations were in the three-dimensional structure and classified in three kinds: (1) mutations close to the ATP binding site (catalytic site), (2) mutations in the substrate binding site (SBS), and (3) mutations in other structured regions of TrkA, that can prevent correct protein folding. We validated in vitro one of the CIPA mutations (R654C), both as a mutation at the ATP binding site and in the SBS region. As predicted in the modeling, this mutation presented total inactivation of TrkA. The nonsense and frameshift mutations would also significantly affect TrkA structure, although some of them such as Q770*, Q782*, V777Cfs*91 and L784Sfs*79, would lead to theexpression of a truncated protein, specifically effecting PLC anchoring, their presence triggered the phenotype of CIPA in patients, indicating that the activation of PLCγ would be an important route for the occurrence of pain. Based on these results, a peptide was developed that inhibits an interaction of TrkA and PLCγ, called QYP. In HEK 293 cells transfected with TrkA, this peptide was capable of inhibiting PLCγ activation mediated by NGF. In addition, in in vivo behavioral trials of acute and CFA-induced inflammatory pain, QYP was able to inhibit mechanical hypersensitivity and partially caused by inflammation for up to 6 hours. QYP also proved to be more efficient than commercial inhibitors (GNF, TrkA inhibitor and U73347, PLC inhibitor) in reversing painful sensitivity. Based on our results, we validate that the PLCγ pathway is essential for the development of mechanical pain, which is a potential target for the development of new analgesics. In addition, the QYP peptide has been shown to be effective in reversing acute and chronic mechanical painful sensitivity in in vivo models of inflammatory pain