Immunopheonotypic and molecular characterization of monocyte subpopulations in Myeloproliferative Neoplasms

Neoplasias Mieloproliferativas (NMP) são desordens hematológicas clonais caracterizadas pela hiperproliferação e acúmulo de células mielóides precursoras e maduras na medula óssea e no sangue periférico. As NMP BCR-ABL1 negativas avaliadas, neste estudo, foram a Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MF). A fisiopatologia destas doenças está associada à presença de mutações envolvendo os genes Janus Kinase 2 (JAK2), Calreticulina (CALR), receptor de trombopoetina (MPL) e alterações de complexos epigenéticos. Apesar da hematopoese desregulada nas NMP ser atribuída principalmente às mutações genéticas na célula-tronco hematopoética, anormalidades no sistema imune e nas células que compõem o microambiente medular parecem contribuir para a fisiopatologia destas doenças. Recentemente, as NMP foram consideradas doenças pré-leucêmicas oncoinflamatórias, visto que os pacientes possuem níveis de citocinas, quimiocinas e marcadores inflamatórios elevados no plasma e medula óssea, e, portanto, apresentam um estado de atividade inflamatória exacerbada, fator que contribui para a instabilidade genética e alterações cardiovasculares. As subpopulações de monócitos humanos, subdivididas em clássicos, intermediários e não clássicos, têm sido envolvidas na gênese e na modulação de condições inflamatórias crônicas, autoimunes e neoplásicas. Embora estudos evidenciem a presença de monocitose em pacientes com NMP, o perfil imunofenotípico dos monócitos nestas doenças ainda não foi elucidado. Nesse contexto, o presente trabalho caracterizou o perfil imunofenotípico e molecular dos monócitos do sangue periférico de pacientes com PV, TE, MF e indivíduos saudáveis. Os monócitos do sangue periférico foram isolados e submetidos à imunofenotipagem para determinação da frequência de subpopulações circulantes e da densidade de expressão dos marcadores CD56, CD64, CD80/86 e HLA-DR. Foi quantificada a concentração plasmática do marcador CD163 solúvel por ELISA e o transcriptoma dos monócitos foi analisado \"in silico\". Em comparação aos controles, pacientes com PV, TE e MF apresentaram maior frequência de monócitos intermediários e não clássicos e menor frequência de monócitos clássicos. Foi identificada maior frequência de monócitos expressando HLA-DR nas três doenças, indicativo de alta ativação celular, ao passo que a expressão de CD80/86 foi menor nos monócitos de pacientes com PV e TE do que nos pacientes com MF e controles, indicando que, nestas doenças, parece haver menor estímulo do processo de coestimulação. A frequência de monócitos positivos para o marcador aberrante CD56 foi maior nas três NMP, principalmente na MF. A concentração plasmática de CD163, indicadora de ativação de monócitos, está elevada nos pacientes com PV, TE e MF. A análise do transcriptoma de pacientes com NMP revelou diferentes assinaturas imunológicas entre pacientes com PV, TE e MF, além de indicar a ativação de vias inflamatórias nos monócitos, possíveis alterações no metabolismo celular, na regulação da apoptose, atividades associadas à coagulação e ao estado pró-trombótico, à interação com neutrófilos e plaquetas, além de genes associados à atividade de interferons do tipo I e do tipo II. Em conjunto, os resultados obtidos sugerem que o aumento na frequência de monócitos intermediários e não clássicos contribui para o processo de oncoinflamação nas NMP. PV e TE compartilharam monócitos com perfis imunofenotípicos similares, marcados por alta ativação e menor potencial co-estimulatório. O aumento na frequência de monócitos CD56 positivos sugere a existência de um processo de imunovigilância mediado pelos monócitos nas NMP, visto que estas células estão associadas à indução da atividade citotóxica e resposta imune antitumoral. Em conclusão, os monócitos parecem ser influenciados pelas alterações fisiopatológicas desencadeadas pelo processo neoplásico nas NMP e podem ser considerados como potenciais alvos de investigação para intervenções farmacológicas nestas doenças.Myeloproliferative Neoplasms (MPN) are clonal hematological disorders characterized by the hyperproliferation and accumulation of precursor and mature myeloid cells in the bone marrow and peripheral blood. The BCR-ABL1-negative MPN evaluated in this study were Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (MF). The pathophysiology of these diseases is associated with the presence of mutations involving the Janus Kinase 2 (JAK2), Calreticulin (CALR), thrombopoietin receptor (MPL) genes and changes in epigenetic complexes. Although dysregulated hematopoiesis in MPN is mainly attributed to genetic mutations in the hematopoietic stem cell, abnormalities in the immune system and in the cells that compose the bone marrow microenvironment seem to contribute to the pathophysiology of these diseases. Recently, MPN have been considered as pre-leukemic oncoinflammatory diseases, once the patients have elevated levels of cytokines, chemokines and inflammatory markers in plasma and bone marrow. The MPN present a state of exacerbated inflammatory activity, which contributes to genetic instatility and cardiovascular damages in patients. Human monocyte subpopulations, subdivided into classical, intermediate and non classical, have been involved in the genesis and modulation of chronic inflammatory, autoimmune and neoplastic conditions. Although studies show the presence of monocytosis in MPN patients, the immunophenotypic profile of monocytes in these diseases has not been elucidated yet. In this context, the present study characterized the immunophenotypic and molecular profile of peripheral blood monocytes from patients with PV, ET, MF and healthy subjects. Peripheral blood monocytes were isolated and submitted to immunophenotyping to determine the frequency of circulating subpopulations and the expression of CD56, CD64, CD80/86 and HLA-DR markers. The plasma concentration of the soluble CD163 marker was quantified by ELISA and the monocytes transcriptome was analyzed by the in silico methodology. Compared to controls, PV, ET and MF patients had increased frequency of intermediate and non classical monocytes and lower frequency of classical monocytes. Higher expression of HLA-DR was identified in monocytes in the three disease categories, indicating cell activation. The expression of CD80/86 was lower in monocytes from patients with PV and ET than in patients with MF and controls, indicating that, in these diseases, there seem to be more monocytes with less costimulatory activity. The frequency of CD56-positive monocytes was increased in the three MPN, mainly in MF. The plasma concentration of CD163, an indicator of monocyte activation, is elevated in PV, ET and MF patients. The MPN patients transcriptome revealed distint immunological signatures among patients with PV, ET and MF, and indentified the activation of inflammatory pathways in monocytes, possible alterations in cellular metabolism, in the regulation of apoptosis, in activities associated with coagulation and prothrombotic state, interaction with neutrophils and platelets, and the differential expression of genes associated with the type I and type II interferon pathways. Taken together, the results suggested that the increased frequency of intermediate and non classical monocytes contributes to the oncoinflammation process in MPN. PV and ET shared monocytes with similar immunophenotypic profiles, marked by high activation and lower costimulatory potential. The increase of the frequency of CD56-positive monocytes suggests the existence of an immunosurveillance process mediated by monocytes in MPN, since these cells are associated with the induction of cytotoxic activity and antitumor immune response. In conclusion, monocytes seem to be influenced by the pathophysiological alterations triggered by the neoplastic process in MPN and should be considered as a potential target for pharmacological interventions in these diseases