Structural and biochemical bases of the essential dimeric interface of the diadenylate cyclase enzyme CdaA from Staphylococcus aureus as a new allosteric site of inhibition

Todos os organismos usam segundos-mensageiros para desencadear cascatas de processos moleculares e responder adequadamente aos sinais do ambiente. Especialmente em bactérias, os segundos-mensageiros mais comuns são baseados em nucleotídeos, cAMP, (p)ppGpp e c-di-GMP. Recentemente, o monofosfato de adenosina dimérico cíclico, c-di-AMP, surgiu como um novo e único segundo- mensageiro essencial, especialmente em bactérias Gram-positivas, controlando diferentes processos fisiológicos como homeostase da parede celular, reparo do DNA, transporte e homeostase de íons, regulação da expressão gênica e metabolismo. Sintetizada a partir de duas moléculas de ATP, a maioria das bactérias codifica apenas uma enzima produtora de c-di-AMP, a CdaA, incluindo Staphylococcus aureus, um conhecido patógeno humano importante capaz de adquirir facilmente resistência a antibióticos. Isso coloca a CdaA como um potencial alvo molecular para o desenvolvimento de novos medicamentos. Mais recentemente, estudos estruturais da CdaA revelaram um dímero cataliticamente incompetente, em que os sítios de ligação ao ATP de cada protômero se encontram em direções opostas. Essa organização oligomérica é completamente diferente da competente diadenilato ciclase octamérica, DisA, a primeira enzima DAC estudada. Apesar dos avanços recentes, os mecanismos aprofundados da síntese de c-di-AMP, especialmente pela CdaA, são pouco conhecidos e até o momento, nenhum estudo anterior explorou seu potencial como um novo alvo molecular. Aqui, é mostrado um ensaio cristalográfico em larga escala com a CdaA de S. aureus (SaCdaA) em que foram identificados alguns sítios de interação, incluindo um bolsão na interface dimérica essencial. Estudos biofísicos revelaram que a ligação do ATP+Mn2+ induz uma mudança conformacional no β2-α3-loop presente na interface dimérica, possibilitando o encontro produtivo face-a-face de dois dímeros diferentes para a síntese de c-di-AMP. Ainda, resultados cinéticos mostram que a SaCdaA exibe uma atividade cooperativa e de inibição por substrato. Em conjunto, os resultados cristalográficos e biofísicos colocam a interface dimérica como um potencial sítio alostérico de inibição nunca explorado antes, e avançam no entendimento dos mecanismos de síntese do c-di-AMP, confirmando a CdaA como um interessante alvo molecular para o desenvolvimento de novos antibióticos e terapias até para as infecções causadas por cepas multirresistentes de S. aureus.All organisms employ second messengers to trigger cascades of molecular processes to properly respond to environmental cues. Especially in bacteria, the most common second messengers are based in nucleotides, e.g., cAMP, (p)ppGpp and c-di-GMP. Recently, the cyclic dimeric adenosine monophosphate, c-di-AMP, emerged as a novel and essential second messenger, especially in Gram-positive bacteria, controlling a variety of physiological processes such as cell wall homeostasis, DNA repair, ion transport and homeostasis, regulation of gene expression and metabolism. Synthesized from two ATP molecules, most bacteria encode only one c-di-AMP-producing enzyme, CdaA, including Staphylococcus aureus, a well-known important human pathogen capable of easily acquiring antibiotic resistance. This puts the CdaA as a potential molecular target for new drug development. More recently, structural studies of CdaA revealed a catalytically incompetent dimer, where the ATP binding sites of each protomer faces opposite directions. This assembly is completely different from the competent octameric diadenylate cyclase DisA, the first DAC-enzyme studied. Despite recent advances, the in-depth mechanisms of c-di-AMP synthesis, especially by the CdaA, are poorly known and to date, no previous studies have explored its potential as a new molecular target. Here we report a high-throughput crystallographic assay with S. aureus CdaA (SaCdaA) in which were identified several interaction sites, including a pocket at the essential dimeric interface. Biophysical studies revealed that ATP+Mn2+ binding induces a conformational change at the β2-α3-loop present at the dimeric interface, enabling the productive face-to-face encounter of two different dimers for c-di-AMP synthesis. Furthermore, kinetic results show that SaCdaA exhibits a cooperative and substrate-inhibiting activity. Together, the crystallographic and biophysical results place the dimeric interface as a potential allosteric site of inhibition never explored before, and sheds light on the mechanisms underlying c-di-AMP synthesis, confirming CdaA as an interesting molecular target for the development of new antibiotics and therapies even for infections caused by multiresistant strains of S. aureus