ECP pili function in atypical enteropathogenic Escherichia coli pathogenesis.

Um passo essencial na colonização do trato gastrointestinal por um patógeno é a adesão à superfície da célula hospedeira e é uma fase crítica nas infecções causadas por Escherichia coli enteropatogênica. Algumas adesinas estão envolvidas no processo multifatorial que é a adesão bacteriana. Entre elas, estruturas denominadas fímbrias compreendem um grupo de adesinas que permite a ligação inicial de bactérias a células epiteliais e subsequente colonização. E. coli enteropatogênica atípica (aEPEC) é um patótipo heterogêneo e nenhum marcador de adesão representativo foi identificado até o momento. A maioria das cepas patogênicas e não patogênicas de E. coli apresentam a fímbria E. coli common pilus (ECP) e, apesar da importância in vitro, não há relatos de sua função na infecção in vivo por aEPEC. Nesse contexto, o zebrafish foi selecionado como modelo de infecção por apresentar as seguintes vantagens: pequeno tamanho, tempo de geração curto, similaridade genômica com mamíferos e sistema imunológico bem desenvolvido. A sua transparência durante o desenvolvimento permite acompanhar a colonização intestinal por patógenos e interações micróbio-hospedeiro, em tempo real, durante todo o curso da infecção. Além disso, o intestino deste animal apresenta microbiota, anatomia e células semelhantes ao intestino de mamíferos, sendo um excelente modelo para a caracterização de adesinas de aEPEC. No presente estudo, avaliamos o papel de ECP na patogênese da aEPEC em um modelo in vivo. Nossos resultados mostraram que 96% das cepas de aEPEC possuem operon ecp completo e 55% são produtores de ECP. A deleção em ecpA ou ecpRABCDE não afetou a capacidade de crescimento, motilidade ou alterou o padrão de biofilme. A BA1250 colonizou efetivamente o zebrafish ao longo do ensaio de colonização intestinal. Como esperado, o &#916ecpA teve uma redução significativa na adesão comparado com WT. Surpreendentemente, o &#916ecpRABCDE não reduziu a adesão e colonizou consistentemente por 72 hpi. &#916ecpRABCDE::mCherry mostrou modificação do local de colonização em comparação com o WT apenas nas 24 hpi iniciais, revertida para o mesmo padrão observado no WT após 72 hpi. Para estudar o papel da ECP em diferentes locais de infecção, os embriões foram infectados na cavidade pericárdica. Nas infecções por WT e &#916ecpRABCDE, apenas 25 e 32% dos embriões sobreviveram, respectivamente. Por outro lado, 100% dos embriões sobreviveram na infecção por &#916ecpA. Em uma infecção sistêmica, observou-se um padrão de sobrevivência semelhante, onde 86% dos embriões infectados com &#916ecpA sobreviveram, em comparação com 52 e 41% de sobrevida nas infecções por WT e &#916ecpRABCDE, respectivamente. Este estudo estabeleceu um modelo in vivo que permite uma triagem rápida de quais estruturas de adesão são essenciais para infecções por aEPEC. Também revelou que a ECP é realmente importante não apenas para a adesão intestinal, mas pode ser uma estrutura crucial para outros grupos de E. coli colonizarem locais diferentes.An essential step in gastrointestinal tract colonization by a pathogen is the adhesion to host cell surface and is a critical point in infections caused by enteropathogenic Escherichia coli. Bacterial adhesion is a multifactorial process in which some adhesins are involved. Among them, structures called pili comprise a group of adhesins that allows the initial binding of bacteria to epithelial cells and subsequent colonization. Atypical enteropathogenic E. coli (aEPEC) is a heterogeneous pathotype and no representative adhesion marker was identified so far. The E. coli common pilus (ECP) is found in most pathogenic and non-pathogenic strains of E. coli, and despite the importance of ECP in vitro, there are no reports of its function in in vivo infection by aEPEC. In this context, zebrafish was selected as infection model due to advantages as its small size, short generation time, genomic similarity with mammals and welldeveloped immune system. Due to its transparency during development, we may follow pathogen intestinal colonization and microbe-host interactions within a live vertebrate host, in real time, throughout the course of infection. Moreover, zebrafish intestine presents microbiota, an intestinal anatomy and cell elements closely related to mammalian intestine, thus an excellent model for aEPEC adhesins characterization. In the present study we evaluated the role of ECP in aEPEC pathogenesis in an in vivo model. Our results showed that 96% of aEPEC strains presented ecp complete operon, and 55% were ECP producers. Deletion of either ecpA or ecpRABCDE had no effect in growth capacity, motility or biofilm pattern. BA1250 was able to effectively colonize zebrafish with a regular CFU/embryo rate over the course of intestinal colonization assay. As expected, &#916ecpA had a significant reduction in adhesion compared to WT. Surprisingly, &#916RABCDE had no decrease of adhesion and also a regular CFU/embryo rate for 72 hpi. &#916ecpRABCDE::mCherry showed modification of colonization site compared to WT only in the initial 24 hpi, reverted to the same WT pattern seen after 72 hpi. To study ECP role in different infection sites, embryos were infected in pericardial cavity. In WT and &#916ecpRABCDE infection only 25 and 32% of embryos survived, respectively. Conversely, 100% of embryos survived in &#916ecpA infection. In a systemic infection similar survival pattern was observed, where 86% of embryos infected with &#916ecpA survived, compared to 52 and 41% of survival in WT and &#916ecpRABCDE infections, respectively. This study has established an in vivo model that allows a fast screening of which adhesion structures are essential to aEPEC infections. It also revealed that ECP is really important not only for intestinal adherence, but it may be a crucial structure for others E. coli groups to colonize different sites