Hlutverk non-coding RNA og peroxidasins í frumusérhæfingu og greinóttri formgerð í brjóstafrumulínu með stofnfrumueiginleika

Brjóstkirtillinn er greinótt líffæri sem skiptist í bleðla og samanstendur af tvískiptri þekju af hollægum þekjufrumum og vöðvaþekjufrumum. Grunnhimnan, sem meðal annars er rík af kollagen IV, skilur þekjuna frá bandvefnum í kring en í honum má finna æðaþel, bandvefsfrumur og ónæmisfrumur. Brjóstkirtill kvenna nýtur sérstöðu þar sem meirihluti þroskaferils hans á sér stað eftir að fósturskeiði er lokið, aðallega á kynþroskaskeiði, en kirtillinn lýkur ekki fullum þroska fyrr en á meðgöngu. Við þetta greinast kirtileiningar í bleðlum enn frekar og mjólkurmyndandi þekjueiningar myndast. Vísir að þessu ferli á sér stað í hverjum tíðahring þegar kirtillinn býr sig undir mögulega meðgöngu og því skiptast á tímabil uppbyggingar og niðurbrots á meðan á frjósemistímabili kvenna stendur. Þessu ferli er viðhaldið af stofnfrumum og þekjuforverum sem sérhæfast í hollægar kirtilþekjufrumur eða vöðvaþekjufrumur ásamt því að viðhalda eigin stofnum. D492 er frumulína með stofnfrumueiginleika sem einangruð var úr eðlilegum brjóstvef. Frumulínan getur myndað frumur sem hafa hvor um sig eiginleika kirtilþekju og vöðvaþekju og myndar þyrpingar með greinótta formgerð í þrívíðri rækt. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að báðar svipgerðir eru nauðsynlegar fyrir greinótta formgerð í þrívíðum þyrpingum D492 frumulínunnar. Þar að auki er bandvefsumbreyting þekjufrumanna í kirtlinum nauðsynleg til að frumurnar geti skriðið inn í umlykjandi stoðvef og myndað greinótta formgerð. Ýmsir þættir koma að stýringu greinóttrar formgerðar, bandvefsumbreytingar og frumusérhæfingar í þekju brjóstkirtilsins. Í doktorsverkefni mínu beindi ég sjónum að ncRNA sameindum og grunnhimnuþættinum peroxidasin (PXDN) og notaði D492 frumulínuna ásamt dótturlínunni D492M, sem hefur bandvefseiginleika, til að rannsaka hlutverk þessara þátta í fyrrnefndum ferlum. Í fyrstu greininni rannsökuðum við hlutverk miR-203a í bandvefsumbreytingu í D492/D492M frumumódelinu og greinóttri formgerð í iv D492. Niðurstöður sýndu að tjáning miR-203a eykst í samræmi við myndun greinóttrar formgerðar. Einnig kom í ljós að tjáning miR-203a er lítil sem engin í D492M miðað við D492 en yfirtjáning á miR-203a í D492M leiddi að hluta til viðsnúnings á bandvefsumbreytingu með aukinni tjáningu á luminal og basal markerum. Einnig kom í ljós að í D492MmiR-203a dró mest úr tjáningu PXDN. Við staðfestum síðar að PXDN er markgen miR-203a sem binst við bindiset á 3‘UTR próteinsins og veldur þar með niðurtjáningu. Önnur greinin segir frá meginrannsókn doktorsverkefnisins sem beindist að PXDN próteininu, sem myndar krosstengi á milli kollagen IV sameinda, og hlutverki þess í frumusérhæfingu og myndun greinóttrar formgerðar í D492. Yfirtjáning á PXDN í D492 sýndi að próteinið ýtti undir ósérhæfða basal svipgerð og dró um leið úr kirtilþekju- og vöðvaþekjusérhæfingu. Þetta leiddi til hindrunar á myndun greinóttrar formgerðar þar sem þörf er á bæði vöðvaþekju og kirtilþekju. Jafnframt kom fram aukin tjáning á umritunarþættinum p63, sem þekkt er að viðheldur basal svipgerð í brjóstaþekju. RNA raðgreining sýndi að auki að gen sem taka þátt í ferlum tengdum sérhæfingu og þroskun þekjuvefja voru með aukna tjáningu en að sama skapi var virkni í bandvefsumbreytingu þekjuvefjar, sem er nauðsynlegur ferill í greinóttri formgerð, verulega skert. Niðurstöður rannsóknarinnar sýndu fram á áður óþekkt hlutverk PXDN í frumusérhæfingu í brjóstkirtlinum en genið hafði fram til þessa ekki verið skoðað í þessu tilliti. Í þriðju greininni var hlutverk lncRNA sameindarinnar MEG3 í bandvefsumbreytingu og frumusérhæfingu í D492/D492M frumumódelinu kannað. Þar kom í ljós að MEG3 er bundið við bandvefslíka svipgerð en tjáning þess var marktækt hærri í bandvefslíkum frumulínum miðað við þekjufrumulínur. Við yfirtjáningu á MEG3 í D492 varð svipgerðarbreyting í átt að basal svipgerð ásamt marktækri aukningu á bandvefslíkum eiginleikum og meðfylgjandi aukinni tjáningu á bandvefskennipróteinum. Þar að auki dró úr greinóttri formgerð í D492MEG3. Við niðurslátt á MEG3 í D492M varð viðsnúningur á bandvefsumbreytingu og þekjueiginleikar jukust, þó aðeins í átt að kirtilþekjusvipgerð. Þessar niðurstöður voru staðfestar með RNA v raðgreiningu sem sýndi fram á að dregið hafði úr virkni bandvefsumbreytingar samfara niðurtjáninu á bandvefsgenum og aukningu á kirtilþekjugenum. Til samantektar varpaði ég ljósi á hlutverk ncRNA sameindanna MEG3 og miR-203a í bandvefsumbreytingu, frumusérhæfingu og greinóttri formgerð í D492 og D492M en einnig bar ég kennsl á PXDN sem markgen miR-203a. Í framhaldinu sýndi ég fram á að PXDN, sem hingað til hefur ekki verið rannsakað í brjóstaþekju, eykur basal svipgerð í D492 en dregur úr frumusérhæfingu og hindrar myndun greinóttrar formgerðar í D492.The mammary gland is a branched, lobular organ comprised of terminal duct lobular units (TDLUs) that contain bilayered epithelium of inner luminal cells and outer myoepithelial cells. The basement membrane, with collagen IV as the chief component, separates the epithelium from the surrounding stroma which is rich in fibroblasts, microvessels, and immune cells. The human female mammary gland is unique as its main developmental period occurs long after birth during puberty, and full maturity is not reached until pregnancy where branching is increased, and milk-producing units are formed. Furthermore, the gland undergoes cyclical changes during each menstrual cycle in preparation for a possible pregnancy, where the epithelium expands and is subsequently broken down if pregnancy does not occur. This process is maintained by epithelial stem cells and progenitor cells that differentiate into luminal and myoepithelial cells in addition to maintaining their population. D492 is a breast epithelial cell line with stem cell properties, isolated from the suprabasal subpopulation of normal breast epithelium. The suprabasal population is believed to contain mammary stem cells, reflected in the ability of D492 cells to undergo branching morphogenesis when cultured under three-dimensional conditions. These branching structures resemble the TDLUs of the breast and require plasticity of D492 cells which can form populations of cells with luminal and myoepithelial characteristics. In addition to epithelial plasticity, epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is a central process in branching morphogenesis in the breast, as epithelial cells require mesenchymal characteristics to be able to migrate into the surrounding matrix when branches are being formed. A myriad of factors is involved in the control of branching morphogenesis, EMT, and epithelial differentiation within the breast. In my Ph.D. project, I applied the D492 cell model along with its mesenchymal daughter cell line D492M and focused on the role of the ncRNAs MEG3 and miR-203a and the basement membrane factor peroxidasin (PXDN) in these processes. viii The first article focused on the role of microRNA (miRNA) miR-203a in EMT in D492 and D492M in addition to branching morphogenesis in D492. Small RNA sequencing revealed that miR-203a expression is increased during branching with increased colony complexity and cell differentiation. Furthermore, we found that miR-203a was significantly less expressed in D492M compared to D492. Overexpression of miR-203a in D492M lead to partial mesenchymal-to-epithelial transition (MET) with upregulation of both luminal and basal markers. We also found that PXDN was the most downregulated gene in D492MmiR-203a. Subsequently, we confirmed that miR- 203a targets the 3‘UTR of PXDN, resulting in post-transcriptional downregulation. In the second article, I present data which were the main focus of my Ph.D. project, the collagen IV crosslinker PXDN and its role in epithelial differentiation and branching morphogenesis in D492. Overexpression of PXDN in D492 eliminated the luminal and myoepithelial phenotype while inducing undifferentiated basal phenotype, thereby negatively affecting plasticity that is characteristic for the D492 cell line. This led to complete inhibition of branching morphogenesis. I also present evidence that induction of basal phenotype in D492PXDN cells is mediated through upregulation of p63, which maintains basal phenotype in breast epithelium. Furthermore, RNA-sequencing reveals significant enrichment in pathways involved in epithelial differentiation and development in D492PXDN while EMT, a significant pathway involved in branching morphogenesis, is significantly downregulated. In the third article, the role of the long non-coding RNA (lncRNA) MEG3 in EMT and epithelial differentiation in D492 and D492M was explored. Results showed that MEG3 expression was associated with mesenchymal phenotype and was significantly higher in mesenchymal cell lines. Overexpression of MEG3 in D492 was accompanied by increased basal and mesenchymal features and reduced branching morphogenesis. With knock-down of MEG3 in D492M partial MET was observed with an increase in epithelial markers but only towards the luminal phenotype. Results from D492M were confirmed ix by RNA sequencing which showed that the EMT pathway was downregulated with simultaneous downregulation of mesenchymal genes and upregulation of luminal markers To summarize, I investigated the role of ncRNAs MEG3 and miR-203a in EMT, epithelial differentiation, and branching morphogenesis in the D492 and D492M cell lines. Furthermore, I identified PXDN, a collagen IV crosslinker previously unexplored in the mammary gland, as a target of miR-203a. Subsequently, I showed that PXDN induces basal phenotype and stemness with a simultaneous reduction in differentiation and inhibition of branching morphogenesis in D492. In addition, I showed that this effect was elicited through the p63, presenting a novel link to PXDN