Production of transgenic sheep: Microinjection of the bovine P77 gene construct in Chios sheep breed zygotes

Στην εργασία αυτή μελετήθηκε η δυνατότητα ενσωμάτωσης της γονιδιακής κατασκευής Ρ77 των βοοειδών σε ζυγωτά και έμβρυα δυο κυττάρων προβάτων φυλής Χίου. Η γονιδιακή κατασκευή Ρ77 των βοοειδών περιλαμβάνει 2,9 kb από τον προαγωγέα του γονιδίου της α8 1 - καζεΐνης που συγχωνεύθηκαν με το γονίδιο της χυμοζίνης ανάμεσα στο 2 και 9 εξονιο. Η έγχυση της γονιδιακής κατασκευής έγινε με μικροχειριστήριο υπό παρατήρηση σε ανάστροφο μικροσκόπιο σε έναν από τους δυο προπυρήνες του ζυγωτοΰ ή στον πυρήνα του ενός βλαστομεριδίου του εμβρύου. Σε κάθε πυρήνα έγινε μικροέγχυση διαλύματος 1 pi, το οποίο περιείχε περίπου 1000 αντίγραφα της αλληλουχίας DNA. Χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 193 ζυγωτά και 87 έμβρυα δυο κυττάρων, τα οποία συλλέχθηκαν από 49 προβατίνες δότες φυλής Χίου. Τα 175 ζυγωτά και τα 76 έμβρυα δυο κυττάρων, στα οποία η μικροέγχυση διενεργήθηκε με επιτυχία, μεταφέρθηκαν με λαπαροσκοπικές τεχνικές στους ωαγωγοΰς 68 προβατίνων δεκτών μετά από in vitro καλλιέργεια 1-5 ωρών. Οι 22 (32,4%) από τις προβατίνες δέκτες γέννησαν 29 αρνιά που αντιστοιχούν στο 11,6% του συνόλου των ζυγωτών - εμβρύων που μεταφέρθηκαν. Η ανάλυση της γενετικής σύστασης των αρνιών που γεννήθηκαν έγινε με τεχνικές PCR σε δείγματα δέρματος. Σε ένα θηλυκό αρνί διαπιστώθηκε ενσωμάτωση της γονιδιακής κατασκευής Ρ77 των βοοειδών στο γονιδίωμά του. Η ανάπτυξη και ενήβωση του διαγονιδιακοΰ αρνιού είναι φυσιολογική, βρίσκεται δε σε κατάσταση εγκυμοσύνης, η οποία εξελίσσεται φυσιολογικά. Είναι το πρώτο διαγονιδιακό παραγωγικό ζώο που γεννήθηκε στην Ελλάδα.The feasibility of integration of the bovine P77 construct into zygotes and two cell embryos of Chios sheep breed was examined. The P77 gene construct comprised bovine as l casein promoter regulatory sequence fused to the fragment between exons 2 and 9 of the bovine chymosin gene. One of the two pronuclei of the zygote or a nucleus of a blastomere of a two cell embryo was microinjected with 1 pi of DNA solution containing approximately 1000 copies of the gene construct. In total 193 zygotes and 87 two cell embryos collected from 49 donor ewes were used. After 1 - 5 h culture microinjected zygotes (n=175) and two cell embryos (n=76) were transferred by a laparoscopic technique to the oviducts of 68 recipients. 22 recipients (32.4%) gave birth to 29 lambs which correspond to 11.6% of the total number of zygotes - embryos transferred. PCR analysis performed in skin samples of these lambs revealed that in one ewe lamb the P77 construct has been integrated in its genome. The growth and puberty of this lamb was physiological and is currently pregnant. This is the first transgenic farm animal born in Greece