Investigação do papel dos astrócitos na patofisiologia da esclerose múltipla

Tese de Doutoramento em Envelhecimento e Doenças CrónicasThe presence of reactive astrocytes in multiple sclerosis (MS), a chronic inflammatory disease of the central nervous system, has been described for a long time, however its contribution for disease pathophysiology is still not fully understood. Therefore, in this work we proposed to further explore the contribution of astrocytes in MS using different experimental approaches. We started by performing a temporal transcriptomic analysis of astrocytes in the chronic experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) MS animal model. For that we isolated astrocytes from the cerebellum in 3 disease time points: before the symptom’s appearance (pre-symptomatic phase), at the onset/peak of the disease and at the chronic phase of EAE. Particularly at the onset phase of disease, astrocytes overexpressed genes associated with a neurotoxic phenotype (known as A1 phenotype), along with the overexpression of genes involved in metabolic pathways, like glycolysis and tricarboxylic acid cycle. This suggested that astrocytes could be undergoing metabolic reprogramming, similarly to what happens in macrophages/microglia in response to different inflammatory stimuli. On the second part of this work, we induced EAE in a model that presents “silent” astrocytes, i.e. astrocytes that present minimal calcium elevations in the soma and main processes, due to the ablation of the inositol 1,4,5-triphosphate receptor type 2 (IP3R2-null). IP3R2- null mice and wild-type littermates presented similar disease clinical scores, however IP3R2-null mice had decreased lesion burden in the cerebellum white matter, which could be associated with the increased astrocyte reactivity observed in these mice near the lesions, compared to the normal appearing white matter. Next, we studied the effects of a neuroprotective drug, dimethyl fumarate (DMF), on astrocyte activation and on the cognitive function in the EAE model. DMF treatment, started at the symptomatic phase of disease, was able to reduce astrocyte reactivity, evaluated by a decrease in the number of cells, and demyelination in the fimbria, which is the most important white matter pathway in the hippocampus, possibly contributing to the prevention of cognitive deficits observed in DMF-treated EAE animals. Finally, we focused our attention on a protein produced by astrocytes during EAE, lipocalin-2 (LCN2), an acute phase protein that was previously suggested as a possible disease biomarker. After the quantification of LCN2 concentration in cerebrospinal fluid samples from MS patients, we observed that increased LCN2 levels were associated with faster disease progression. However, this association was no longer statistically significant after controlling for the patients’ age and the presence of oligoclonal bands.A presença de astrócitos reativos na esclerose múltipla (EM), uma doença inflamatória crónica do sistema nervoso central, já é conhecida há muito tempo, porém a sua contribuição para a patofisiologia da doença não está totalmente esclarecida. Assim, neste trabalho propomos explorar a contribuição dos astrócitos na EM usando diferentes abordagens experimentais. Começámos por fazer uma análise temporal do transcriptoma dos astrócitos no modelo animal crónico de EM de encefalomielite autoimune experimental (EAE). Para isso, isolámos astrócitos do cerebelo em 3 momentos experimentais: antes do aparecimento de sintomas (fase pré-sintomática), no pico da doença e na fase crónica. Em particular no pico da doença, os astrócitos sobre-expressaram genes associados a um fenótipo neurotóxico (conhecido como fenótipo A1), e genes envolvidos em diferentes vias metabólicas, tais como a glicólise e o ciclo dos ácidos tricarboxílicos. Estas alterações sugeriram que os astrócitos poderiam estar a passar por um processo de reprogramação metabólica, semelhante ao que acontece com macrófagos/microglia em resposta a diferentes estímulos inflamatórios. Na segunda parte deste trabalho, induzimos EAE num modelo de astrócitos “silenciados”, i.e. astrócitos que apresentam elevações de cálcio mínimas no soma e processos principais, devido à deleção do recetor tipo 2 do inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R2-null). Os animais IP3R2-null e do tipo selvagem das mesmas ninhadas desenvolveram a doença de modo semelhante, no entanto os animais IP3R2-null apresentaram uma diminuição da carga de lesão na substância branca do cerebelo, que poderá estar associada ao aumento da reatividade dos astrócitos observada perto destas regiões de lesão, comparativamente à substância branca aparentemente normal. De seguida, estudámos os efeitos de um fármaco neuroprotetor, o dimetil fumarato (DMF), na ativação dos astrócitos e na função cognitiva no modelo de EAE. O tratamento com DMF, iniciado na fase sintomática da doença, reduziu a reatividade dos astrócitos, avaliada através de uma diminuição do seu número, e a desmielinização na fimbria, que é o feixe de substância branca mais importante no hipocampo, o que poderá ter contribuído para a prevenção de défices cognitivos nos animais EAE tratados com DMF. Por último, focámos a nossa atenção numa proteína produzida pelos astrócitos em resposta à EAE, a lipocalina-2 (LCN2), uma proteína de fase aguda que foi anteriormente sugerida como um possível marcador de doença. Após a quantificação dos níveis de LCN2 no líquido cefalorraquidiano de doentes com EM, observámos que níveis elevados de LCN2 estavam associados a uma progressão mais rápida da doença. Porém, esta associação perdeu a significância estatística após controlar para a idade dos doentes e para a presença de bandas oligoclonais.This work was supported by Foundation for Science and Technology (FCT) and COMPETE through the project EXPL/NEU-OSD/2196/2013 and by The Clinical Academic Center (2CA-Braga) through the project EXPL/001/2016. The work at ICVS/3B’s has been developed under the scope of the project NORTE-01-0145-FEDER-000013, supported by the Northern Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the Portugal 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (FEDER), and funded by FEDER funds through the Competitiveness Factors Operational Programme (COMPETE), and by National funds, through the Foundation for Science and Technology (FCT), under the scope of the project POCI-01-0145-FEDER-007038. FM is an assistant researcher and recipient of an FCT Investigator grant with the reference CEECIND/01084/2017. SN is a recipient of a Ph.D. fellowship with the reference PD/BD/114120/2015 from MCTES national funds