Evaluation of the antimicrobial activity of a bacteriophage-honey formulation in an ex vivo skin model

Dissertação de Mestrado em Engenharia Biomédica (Ramo em Engenharia Clínica)Nowadays, the main treatments used on infected chronic wounds are antibiotics. However, the incorrect and overuse of these led to the appearance of antimicrobial resistances (AMR). In fact, along time multiple bacteria acquired the ability to express properties that help them to engage in a sessile community environment in order to protect themselves from external factors. These communities are called biofilms and are known to be tolerant to biocides and to the host immune response. As so, it is important to find different strategies. This study proposes a bacteriophage-honey combination due to their potential already verified when used separately. The effect of the bacteriophage-honey formulations was tested using both in vitro in polystyrene plates and ex vivo using pig skin explants against the pathogenic bacterial strains Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. The pig skin model was used since it is anatomically similar to human skin. The Portuguese honey C1 with floral origin from Castanea sativa revealed to be sufficient to eradicate completely the E. coli biofilm cells in vitro when used at 50% (w/v) concentration. In ex vivo experiments, honey alone did not demonstrate such high efficacy. In fact, 25% (w/v) concentrated honey resulted in similar biofilm cells reduction effects as 50% (w/v), and a maximum biofilm reduction (2 log) was achieved for both concentrations when combined with phage. The commercial Manuka honey was also tested against E. coli biofilms as a term of comparison, and generally, statistically similar results to C1 for both in vitro and ex vivo experiments were obtained. For P. aeruginosa biofilm cells formed ex vivo, the maximum reduction observed, 2.4 log at 12 h, was obtained with 50% (w/v) C1 together with bacteriophage. This experiment suggests that the surface influences the biofilm structure, leading to different bacteria-surface interactions, and consequently to different responses to the used treatment. Both strains seemed to have benefited from the presence of the other in dual-species biofilms, resulting in a synergistic effect when honey was combined with bacteriophage in the case of P. aeruginosa. In fact, it was obtained a maximum reduction of 3.1 log for P. aeruginosa after 12 h and 1.8 log for E. coli at 24 h when 50% (w/v) C1 was combined with bacteriophage. The synergy is believed to be due to honeys capacity to damage the bacterial cell membrane, promoting the subsequent bacteriophage infection.Atualmente, os principais tratamentos utilizados em feridas crónicas infetadas são antibióticos. No entanto, o uso incorreto e excessivo destes levou ao aparecimento de resistências antimicrobianas (RAM). De facto, ao longo do tempo, múltiplas bactérias adquiriram a capacidade de expressar propriedades que as permitem envolver-se num ambiente comunidade séssil de modo a se protegerem de fatores externos. Essas comunidades chamam-se biofilmes e são conhecidas por serem suscetíveis a biocidas e à resposta imune do hospedeiro. Desta forma, é crucial encontrar diferentes estratégias. Este estudo propõe uma combinação de bacteriófagos-mel devido ao potencial de cada um já verificado quando usados separadamente. O efeito de várias formulações de bacteriófagos-mel foi testado utilizando modelos in vitro, em placas de poliestireno, e ex vivo, utilizando explantes de pele de porco, contra as estirpes bacterianas patogénicas Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. O modelo de pele de porco foi usado, sendo esta anatomicamente mais semelhante à pele humana. O mel português C1 com origem floral de Castanea sativa revelou ser suficiente para erradicar completamente as células de biofilme de E. coli in vitro quando utilizadas a uma concentração de 50% (p/v). Em testes ex vivo, o mel sozinho não demonstrou a mesma eficácia. De facto, o mel concentrado a 25% (p/v) resultou em efeitos de redução de biofilmes semelhantes a 50% (p/v) e foi obtida uma redução máxima de biofilme (2 log) para ambas as concentrações quando combinadas com fago. O mel comercial Manuka também foi testado contra os biofilmes de E. coli, sendo que este mel foi usado como um termo de comparação, e, em geral, foram obtidos resultados estatisticamente semelhantes a C1 para ambos os testes in vitro e ex vivo. Para células de biofilme de P. aeruginosa formadas ex vivo, a redução máxima observada, 2.4 log às 12 h, foi obtida com 50% (p/v) de C1 juntamente com bacteriófagos. Este estudo sugere que a superfície influencia a estrutura do biofilme, sendo que esta leva a diferentes interações bactérias-superfície e, consequentemente, a diferentes respostas ao tratamento usado. No caso dos biofilmes de duas espécies, ambas as estirpes parecem ter beneficiado com a presença uma da outra, sendo que se notou um efeito sinérgico quando o mel foi combinado com bacteriófagos, no caso da P. aeruginosa. De facto, foi obtida uma redução máxima de 3.1 log para a P. aeruginosa após 12 h e 1.8 log para E. coli às 24 h quando 50% (p/v) C1 foi combinado com bacteriófagos. Acredita-se que a sinergia se deva à capacidade do mel para danificar a membrana celular bacteriana, promovendo a subsequente infeção por bacteriófagos.This study was supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) under the scope of the strategic funding of UID/BIO/04469/2013 unit and COMPETE 2020 (POCI-01-0145-FEDER-006684) and BioTecNorte operation (NORTE-01-0145-FEDER-000004) funded by the European Regional Development Fund under the scope of Norte2020 - Programa Operacional Regional do Norte and the Project RECI/BBB-EBI/0179/2012 (FCOMP-01-0124-FEDER-027462) and the project PTDC/CVT-EPI/4008/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016598)