Implicaciones evolutivas de la transmisión colectiva de virus

Es habitual asumir en virología que las partículas virales dispersan de forma libre e independiente durante su transmisión entre células, tejidos, órganos y hospedadores. Sin embargo, esta visión ha sido cuestionada recientemente por la caracterización de múltiples estrategias que los virus emplean para transmitirse colectivamente. Entre ellas se encuentran las llamadas unidades infecciosas colectivas, que incluyen agregados virales, viriones poliploides, vesículas extracelulares o estructuras específicas como los cuerpos de oclusión; pero también diversos modos de transmisión directa y masiva de viriones entre células. En principio, la agrupación de la progenie viral disminuye el número de unidades infecciosas y, por tanto, la capacidad dispersiva de los virus. En consecuencia, para ser selectivamente favorable, la transmisión colectiva debe proporcionar beneficios que compensen su coste. Debido a que todas estas estrategias incrementan la multiplicidad de infección celular, al margen de la densidad de la población viral y del efecto de los cuellos de botella, los virus podrían beneficiarse de interactuar cooperativamente en coinfección. Por ejemplo, la entrada de múltiples genomas virales en la célula podría acelerar el ciclo infectivo y proporcionar una ventaja al virus para superar barreras tempranas frente a la infección o adelantarse a la respuesta antiviral de la célula. Por otro lado, en este mismo contexto, distintas variantes virales podrían interactuar de forma cooperativa (cooperación heterotípica) a través de la complementación genética, la división de labores o distintos tipos de interacciones sinérgicas. No obstante, interacciones como la dominancia negativa y la interferencia también pueden ocurrir, y podrían frustrar la cooperación y promover el conflicto viral. La teoría de la evolución social, ya aplicada con gran éxito al estudio de microorganismos, representa el marco teórico adecuado para analizar, comprender y predecir la dinámica evolutiva de estas interacciones virales. En esta tesis hemos explorado las implicaciones de la transmisión colectiva para la dinámica replicativa de los virus en coinfección y hemos empleado los agregados que forma el virus de la estomatitis vesicular (VSV) al ser incubado en saliva como modelo de estudio para determinar las consecuencias de la transmisión colectiva sobre la eficacia biológica viral. En primer lugar, hemos desarrollado modelos matemáticos y simulaciones que describen la replicación viral para estudiar la dinámica intracelular de las infecciones colectivas. Estos modelos muestran que la replicación es un proceso cooperativo, pues la entrada de múltiples genomas virales en una misma célula adelanta desproporcionadamente el ciclo infectivo, lo que puede acelerar la liberación de progenie viral e incrementar sinérgicamente el éxito infectivo. Los efectos cooperativos de la replicación residen en la realimentación positiva no lineal que los genomas virales establecen con los productos génicos que codifican, lo cual debería ser una característica común entre los virus. De acuerdo con ello, validamos nuestros resultados en modelos más complejos de virus específicos, pero también experimentalmente, empleando seis virus distintos que infectan mamíferos. En segundo lugar, hemos comparado el crecimiento y la eficacia biológica de los viriones libres de VSV frente a agregados en ocho líneas celulares. Para un mismo número de partículas virales, la agregación tendía a acelerar la liberación de progenie e incrementar la eficacia biológica en competencia en la mayoría de líneas celulares analizadas. Estos efectos no parecían depender de la complementación genética entre mutantes deletéreos de nuestras poblaciones virales, pues la ventaja de agregar se revirtió al incrementar la carga mutacional mediante mutagénesis química. No obstante, correlacionaron negativamente con la permisividad de las células a la infección y positivamente con la capacidad inmunitaria innata de las células, indicando la mayor capacidad de los agregados para superar barreras tempranas frente a la infección. En tercer lugar, utilizamos la evolución experimental para analizar las consecuencias no inmediatas de la agregación. A pesar de mantener un régimen de baja densidad viral, la agregación promovió una invasión rápida de las poblaciones virales por partículas interferentes defectivas (DIPs), que detectamos mediante distintas metodologías (citometría de flujo, secuenciación masiva, ensayos de reducción de título, RT-qPCRs y microscopía electrónica). Por tanto, concluimos que la agregación de VSV produce un aumento inmediato en la eficacia del virus, pero incurre en costes posteriores a causa de la proliferación de DIPs. Este escenario dificulta enormemente la evolución de interacciones cooperativas entre variantes virales y promueve un régimen de transmisión colectiva episódico, por ejemplo, durante la transmisión entre hospedadores.It is commonly assumed in virology that viral particles disperse freely and independently during their transmission between cells, tissues, organs and hosts. However, this view has recently been challenged by the characterization of multiple strategies that viruses use for their collective transmission. These include the so-called collective infectious units, such as viral aggregates, polyploid virions, extracellular vesicles or other specific structures such as occlusion bodies; but also a variety of modes for the direct and massive transmission of virions between cells. In principle, the clustering of viral progeny decreases the number of infectious units and thus the ability of viruses to disperse. Consequently, to be selectively advantageous, collective transmission must provide benefits that offset its cost. Because all of these strategies increase the cellular multiplicity of infection, regardless of viral population density and bottleneck effects, viruses could benefit from cooperatively interacting in coinfection. For example, the entry of multiple viral genomes into the cell could accelerate the infectious cycle and provide an advantage for the virus to overcome early infection barriers or preempt the cellular antiviral response. On the other hand, in this same context, different viral variants could interact in a cooperative manner (heterotypic cooperation) through genetic complementation, division of labor or different types of synergistic interactions. However, interactions such as negative dominance and interference can also occur, and could thwart cooperation and promote viral conflict. The theory of social evolution, which has already been applied with great success to the study of microorganisms, represents the appropriate theoretical framework to analyze, understand and predict the evolutionary dynamics of these viral interactions. In this thesis we have explored the implications of collective transmission for the replicative dynamics of co-infecting viruses and have used viral aggregates formed by incubating vesicular stomatitis virus (VSV) in saliva as a study model to determine the consequences of collective transmission on viral fitness. First, we have developed mathematical models and simulations describing viral replication to study the intracellular dynamics of collective infections. These models show that replication is a cooperative process, as the entry of multiple viral genomes into the same cell disproportionately accelerates the infectious cycle, which in turn can accelerate the release of viral progeny and synergistically increase infectious success. The cooperative effects of replication arise from the nonlinear positive feedback that viral genomes establish with the gene products they encode, which should be a common feature among viruses. Accordingly, we validated our results in more complex models of specific viruses, but also experimentally, using six different mammalian viruses. Second, we compared the growth and fitness of free VSV virions versus aggregates in eight cell lines. For the same number of viral particles, aggregation tended to accelerate progeny release and increase fitness in competition in most of the cell lines tested. These effects did not appear to depend on genetic complementation between deleterious mutants of our viral populations, as the advantage of aggregation was reversed by increasing the mutational load by chemical mutagenesis. However, they correlated negatively with cell permissivity to infection and positively with the innate immune response of the cells, indicating a higher capacity of aggregates to overcome early barriers to infection. Third, we used experimental evolution to analyze the non-immediate consequences of aggregation. Despite maintaining a low viral density regime, aggregation promoted a rapid invasion of viral populations by defective interfering particles (DIPs), which we detected by different methodologies (flow cytometry, deep sequencing, yield reduction assays, RT-qPCRs and electron microscopy). Therefore, we conclude that VSV aggregation results in an immediate increase in virus efficacy, but incurs in long-term costs due to the proliferation of DIPs. This scenario greatly hinders the evolution of cooperative interactions between viral variants and favors an episodic collective transmission regime, for instance, during inter-host transmission