Study of new risk factors for the transmission of the hepatitis E virus

El objetivo principal del presente proyecto de tesis doctoral es la identificación de factores de riesgo para la infección por el virus de la hepatitis E (VHE). En este sentido, ya que la infección por el VHE en nuestro medio es zoonótica, es necesario el realizar una aproximación One Health para la evaluación de factores de riesgo de la infección; esto es evaluar los factores tanto en población humana como en población animal. Para llevar a cabo esta evaluación es fundamental disponer de una buena herramienta diagnóstica con el objeto de identificar a los sujetos infectados, así como la optimización del algoritmo diagnóstico que permita identificar a la totalidad de pacientes infectados. El primer paso del proyecto de tesis doctoral ha sido el desarrollo y validación de un método molecular para el diagnóstico de la infección por el VHE con una mayor sensibilidad y especificidad que los métodos moleculares disponibles actualmente. En segundo lugar, se ha realizado la optimización del algoritmo diagnóstico de la infección con el objeto de minimizar el número de pacientes falsos negativos. Una vez optimizado el diagnóstico de la infección por el VHE, se han evaluado los factores de riesgo tanto en población humana como en población animal. Para ello se han establecido cinco objetivos, cuya consecución ha dado lugar a 5 publicaciones científicas. Estos se resumen en los siguientes puntos: Objetivo 1: Desarrollar y validar clínicamente un método molecular con capacidad de detección de todos los genotipos y subtipos de la especie Orthohepevirus A. Debido a la considerable variabilidad que el VHE ha mostrado en la actualidad, no existe un método de cribado por PCR que haya sido diseñado para detectar el amplio espectro de genotipos que presenta esta especie viral. La implementación de un método preciso para la detección de todos los genotipos del VHE actualmente descritos, así como la detección de subtipos no identificados, es necesaria para la salud pública tanto humana como animal, constituyendo la base de un modelo de una única Salud (One Health). Por todo ello, el objetivo de nuestro estudio ha sido el diseñar un método basado en PCR pangenotípica para la detección y cuantificación de ARN del VHE para todo el espectro de genotipos descritos. Los análisis para determinar las condiciones óptimas y el rendimiento de este método se llevaron a cabo mediante el uso del virus estándar de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (6219/10) así como el panel VHE de la OMS (8578/13). Del mismo modo, se realizaron comparaciones de rendimiento de nuestro nuevo método con otros dos métodos comerciales para detectar el ARN del VHE en concentraciones inferiores a 1.000 UI/ml del panel viral de la OMS. Nuestro método demostró mayor sensibilidad que los dos kits comerciales con los que fue comparado (sensibilidad de 100% en comparación con 71,4% [ampliCube 2.0.] y 80.9% [RealStar 2.0.]). Posteriormente realizamos la validación clínica de nuestro método frente a los kits comerciales mediante el análisis de 54 muestras de suero de pacientes con hepatitis aguda comparando la sensibilidad y la especificidad. El método de PCR presentado en este estudio fue capaz de detectar todo el espectro de genotipos descritos pertenecientes a la especie Orthohepevirus A, mostrando un mejor rendimiento que los dos kits comerciales. Por tanto, este procedimiento puede significar una mejora significativa en el diagnóstico molecular de la infección por VHE. Objetivo 2: Optimizar el algoritmo diagnóstico de la infección aguda por el VHE incluyendo la determinación serológica y molecular. Para llevar a cabo nuestro objetivo, realizamos un estudio prospectivo en el que se incluyeron pacientes con sospecha de infección por VHE, definidos como individuos con hepatitis aguda que mostraban resultados negativos para los marcadores serológicos y moleculares de otros virus hepatotropos. Todos los pacientes fueron evaluados para la infección por el VHE, incluyendo análisis de anticuerpos IgM y ARN viral. La infección por el VHE se definió como la positividad de cualquiera de estos marcadores. Se incluyeron 182 pacientes, de los cuales 68 (37,4%) fueron diagnosticados de infección por VHE. De estos, 29 (42,6%) fueron positivos tanto para IgM como para ARN del VHE, 25 (36,8%) fueron positivos sólo para anticuerpos IgM, y 14 (20,6%) fueron positivos sólo para ARN del VHE. Considerando sólo los individuos que fueron positivos a los anticuerpos IgM, se pudieron identificar 54 de los 68 casos (79,4%), mostrando un porcentaje de individuos falsos negativos del 20,6%. En conclusión, el algoritmo de diagnóstico de la infección por VHE en pacientes con hepatitis aguda debería incluir la determinación tanto de anticuerpos IgM como del ARN viral en suero, ya que la toma de muestras única para la determinación de anticuerpos IgM condujo a una proporción importante de pacientes falsos negativos. Objetivo 3: Evaluar si los pacientes infectados por el VIH constituyen un grupo de riesgo de infección por el VHE. No está establecido si las personas infectadas con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) son más susceptibles a la infección por VHE que las personas no infectadas por el VIH. Por esta razón, realizamos una revisión sistemática y metaanálisis que incluían estudios que evaluaban la prevalencia del VHE en esta población, comparándola con individuos no infectados. El análisis incluyó estudios que comparaban pacientes que vivían con el VIH y personas VIH negativas, emparejados por edad, género y área geográfica. Encontramos que las personas infectadas por el VIH no muestran un mayor riesgo para la infección por el VHE, obteniendo una Odds Ratio (OR) de 0,87 (IC del 95%: 0,74-1,03) para efectos fijos, y 0,88 (IC del 95%: 0,70-1,11) para efectos aleatorios (I2 = 47%). De este trabajo concluimos que, en base a los resultados obtenidos, no existen argumentos que recomienden que pacientes infectados por el VIH deban tomar medidas preventivas adicionales a las recomendadas para la población general. Objetivo 4: Evaluar la influencia del gen PROGINS sobre la susceptibilidad y el curso clínico de la infección por VHE. Diseñamos un estudio prospectivo que incluyó tres grupos de pacientes categorizados según el patrón serológico y molecular del VHE: (i) nunca infectados (anticuerpos IgG e IgM así como ARN viral negativos), (ii) infección pasada (anticuerpos IgG positivos, y negativo para IgM y ARN viral), e (iii) infección aguda (anticuerpos IgM positivos y/o ARN viral detectable). Determinamos el genotipo del PR clasificando a los pacientes como homocigotos wild-type, heterocigotos y homocigotos PROGINS. En los pacientes con infección reciente, se recogieron los síntomas clínicos y alteraciones analíticas. En este estudio se incluyeron 311 pacientes infectados por el VIH. De éstos, 198 eran homocigotos para el genotipo wild-type (63,7%), 91 eran heterocigotos (29,3%) y 22 eran homocigotos PROGINS (7,1%). En nuestro estudio encontramos que el genotipo homocigótico PROGINS en mujeres se asoció con una menor seroprevalencia del VHE (100% vs. 0%; p < 0,001). Además, ninguno de los pacientes con una infección reciente por VHE con genotipo homocigoto para el gen PROGINS presentó síntomas (100% vs. 0%; p < 0,001). De este trabajo concluimos que la mutación PROGINS juega un papel protector frente a la infección por VHE y se asocia con la infección subclínica en pacientes infectados por el VIH, especialmente en mujeres. Objetivo 5: Evaluar los factores de riesgo asociados a la infección activa por el VHE en cerdos criados en diferentes sistemas de producción. En este estudio se evaluaron los factores de riesgo asociados con la infección por el VHE en el principal reservorio animal, los cerdos. La identificación de los factores de riesgo asociados con la infección por VHE en esta especie podría ayudar a determinar estrategias de contingencia para minimizar el riesgo de transmisión a los humanos. Se diseñó un estudio prospectivo en el que se incluyeron 1.040 cerdos procedentes de 26 explotaciones de la provincia de Córdoba. La variable desenlace del estudio fue carga viral detectable del VHE en sangre periférica. Se calculó la prevalencia de la infección por VHE en la población global del estudio, así como por diferentes características basales relacionadas con el animal, y variables higiénico sanitarias relacionadas con la explotación de origen. Los factores asociados con la infección por VHE se analizaron mediante análisis multivariante. Ciento setenta y dos cerdos presentaban infección por VHE, resultando una prevalencia del 16,5% (IC del 95%: 14,4% - 18,9%). Los factores asociados con una mayor prevalencia de la infección por VHE fueron: agricultura extensiva [23,9%; OR = 2.239 (1.036–4.837)], ausencia de vado sanitario [33,8%; OR = 3,597 (1,649–7,850)], no usar cuarentena en la reposición de los animales [20,8%; OR = 2.723 (1.450–5.112)], y contacto con otras especies domésticas simpátricas [24,5%; OR = 3,893 (1,453-10,431)]. Nuestro estudio identifica por primera vez el impacto negativo que la ausencia de ciertas medidas higiénico-sanitarias en las explotaciones porcinas en la tasa de infección por el VHE, por lo que su corrección podría reducir el riesgo de infección por VHE en los cerdos, y, por lo tanto, minimizar el riesgo de transmisión zoonótica.The main objective of this doctoral thesis project was to identify risk factors for hepatitis E virus (HEV) infection. Since HEV infection in our environment is zoonotic, the risk factors for infection should be assessed with a One Health approach, that is, by assessing risk factors in both the human and animal populations. To carry out the evaluation, a good diagnostic tool is essential to detect infected subjects, as is an optimized diagnostic algorithm to detect all infected patients. The first step of this doctoral thesis project was to develop and validate a molecular method for diagnosis of HEV infection with higher sensitivity and specificity than the molecular methods currently available. In the second step, the diagnostic algorithm for infection was optimized to minimize the number of false negative patients. The optimized diagnosis of HEV infection was then used to evaluate the risk factors for infection in human as well as animal populations. Five objectives were established, completion of which resulted in 5 scientific publications. These are summarized below: Objective 1: To develop and clinically validate a molecular method capable of detecting all genotypes and subtypes of Orthohepevirus A species. Due to the considerable subtype variability that HEV currently shows, no PCR screening method has been designed to detect the broad spectrum of genotypes exhibited by this viral species. Nevertheless, implementation of an accurate method for the detection of all currently described HEV genotypes, as well as detection of unidentified subtypes, is necessary for both human and animal public health and constitutes the basis of a One Health approach to HEV infection. The objective of our study therefore was to design a PCR-based pangenotypic assay for the detection and quantification of HEV RNA for the entire spectrum of genotypes described. Testing to determine the optimal conditions and performance of this method was performed using the World Health Organization (WHO) standard strain (6219/10) as well as the WHO reference panel of HEV genotypes (8578/13). Comparisons of the performance of our new method against two other commercial methods were also carried out, based on detection of HEV RNA at concentrations below 1,000 IU/ml of the WHO viral panel. Our method demonstrated higher sensitivity than the two commercial kits with which it was compared (100% sensitivity as against 71.4% [ampliCube 2.0.] and 80.9% [RealStar 2.0.]). Our method was then clinically validated against the commercial kits by testing 54 serum samples from patients with acute hepatitis and comparing sensitivity and specificity values. The PCR method presented in this study was able to detect the entire spectrum of described genotypes of Orthohepevirus A species and performed better than the two commercial kits. This procedure could therefore represent a significant improvement in the molecular diagnosis of HEV infection. Objective 2: To optimize the diagnostic algorithm for acute HEV infection by including serological and molecular determinations. For this objective, we conducted a prospective study including patients with suspected HEV infection, defined as individuals with acute hepatitis who tested negative for the serological and molecular markers of other hepatotropic viruses. All patients were assessed for HEV infection using IgM antibody and viral RNA tests. HEV infection was defined as positivity for either of these markers. One hundred and eighty-two patients were included, 68 (37.4%) of whom were diagnosed with HEV infection. Of these, 29 (42.6%) were positive for both IgM and HEV RNA, 25 (36.8%) were positive only for IgM antibodies, and 14 (20.6%) only for HEV RNA. Focusing on those patients who were positive only for IgM antibodies, 54 out of 68 cases (79.4%) were identified, and the percentage of false negative patients was 20.6%. In conclusion, in patients with acute hepatitis, the diagnostic algorithm should include the determination of both IgM antibodies and viral RNA in serum, since single sampling for IgM antibody determination led to a substantial proportion of false negative patients. Objective 3: To evaluate whether HIV-infected patients constitute a risk factor for HEV infection. It has not been established whether patients infected with the human immunodeficiency virus (HIV) are more susceptible to HEV infection than those who are not HIV-infected. Accordingly, we conducted a systematic review and meta-analysis including studies assessing HEV prevalence in the HIV-infected population compared with uninfected individuals. The analysis included studies comparing patients living with HIV and HIVnegative individuals, matched by age, gender and geographical area. We found that patients infected with HIV do not show a greater risk for HEV infection, obtaining an odds ratio (OR) of 0.87 (95% CI: 0.74-1.03) in the fixed effects meta-analysis, and 0.88 (95% CI: 0.70-1.11) in random effects (I2= 47%). Based on the study findings, we concluded that there are no arguments to recommend that HIV-infected patients should adopt extra preventive measures relative to those recommended for the general population. Objective 4: To evaluate the influence of the PROGINS gene on susceptibility and clinical course of HEV infection. We designed a prospective study that included three groups of patients categorized according to serological and molecular pattern of HEV: (i) never infected (negative for IgG and IgM antibodies and negative for HEV RNA); (ii) past infection (positive for IgG antibodies and negative for IgM and viral RNA), and (iii) acute infection (positive IgM antibodies and/or detectable viral RNA). PR genotype was determined, and patients were classified as homozygous wild type, heterozygous, or homozygous PROGINS. The clinical symptoms and analytical alterations in patients with recent infection were collected. This study included 311 HIV-infected patients: 198 had the homozygous wild-type genotype (63.7%), 91 were heterozygous (29.3%), and 22 were homozygous PROGINS (7.1%). Our study found that in women the homozygous PROGINS gene was associated with a lower seroprevalence of HEV. Furthermore, none of the patients with recent HEV infection who were homozygous for PROGINS showed symptoms (100% vs. 0%; p < 0.001). We concluded from this study that the PROGINS mutation has a protective role against HEV infection and is associated with subclinical infection in HEV-infected patients, especially women. Objective 5: To assess the risk factors associated with active HEV infection in pigs reared in different production systems. This study evaluated the risk factors associated with HEV infection in the main animal reservoir, pigs. Identification of risk factors associated with HEV infection in this species could help to establish contingency strategies to minimize the risk of transmission to humans. A prospective study was designed that included 1,040 pigs from 26 farms in the province of Cordoba. The outcome variable was detectable HEV viral load in peripheral blood. The prevalence of HEV was calculated for the overall study population, and for different baseline characteristics of the animals and hygiene and sanitation variables linked to the farm of origin. Factors associated with HEV infection were analyzed by multivariate analysis. One hundred and seventy-two pigs were infected with HEV, giving a prevalence of 16.5% (95% CI: 14.4% -18.9%). Factors associated with higher prevalence of HEV infection were extensive farming [23.9%; OR = 2.239 (1.036-4. 837)], absence of a disinfection ford [33.8%; OR = 3.597 (1.649-7.850)], not applying quarantine for replacement stock [20.8%; OR = 2.723 (1.450-5.112)] and contact with other sympatric domestic species [24.5%; OR = 3.893 (1.453-10.431)]. Our study identifies for the first time the negative impact that the absence of certain hygiene / sanitation measures on pig farms has on the rate of HEV infection. Correcting these could reduce the risk of HEV infection in pigs and consequently minimize the risk of zoonotic transmission