Study of proteins involved in cell wall biosynthesis in response to different stress conditions in yeast : search for therapeutic targets

Introducción: La EFI (Enfermedad fúngica invasiva) han aumentado en los últimos años como resultado del incremento de pacientes inmunocomprometidos, siendo de particular interés las causadas por la levadura C. glabrata (segunda especie más prevalente en el mundo causando candidemia), debido a que con alta frecuencia es resistente a los azoles y con un aumento importante a las equinocandinas, provocando fallas terapéuticas y altas tasas de mortalidad. Por esta razón, la búsqueda de nuevos blancos terapéuticos es relevante; una de las estrategias para lograr identificar posibles blancos es el estudio de proteínas esenciales que participen en la respuesta a los fármacos. Objetivo: Este estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto de la deleción o inhibición de proteínas implicadas en la biosíntesis de pared celular en respuesta a diferentes condiciones de estrés. Metodología: Se evaluaron mutantes haploinsuficientes de S. cerevisiae para 15 proteínas implicadas en la biosíntesis de la pared celular frente a los fármacos caspofungina, fluconazol y frente a diferentes tipos de estrés (térmico, osmótico, oxidativo, agentes disruptores de la pared celular e inhibición de la vía CaM/CaL), además se determinó la susceptibilidad de C. glabrata al inhibidor de la N-glicosilación TM (Tunicamicina) solo y en combinación con caspofungina. Finalmente, con base a los resultados obtenidos en S. cerevisiae se eligieron 2 proteínas para realizar el diseño bioinformático del sistema CRISPR-Cas9 con el interés de evaluar el fenotipo de los mutantes en aislamientos clínicos de C. glabrata resistentes. Resultados: Se encontró que la deleción de genes asociados con la biosíntesis de manoproteínas conduce a una disminución de la CMI (Concentración mínima inhibitoria) en presencia de caspofungina, además que las proteínas de tipo GPI son importantes en la respuesta al fluconazol, por otro lado, la depleción de alguno de los genes implicados en la biosíntesis o formación de la pared celular genera levaduras con mayor susceptibilidad frente agentes disruptores de esta. Se identificó que la proteína con anclaje GPI Ecm33 participa en la respuesta de la mayoría de las condiciones evaluadas y que la vía de señalización CaM/CaL es importante en la respuesta frente al fluconazol y la TM. Por otro lado, la combinación de TM y caspofungina logro disminuir la CMI en aislados de C. glabrata resistentes. Adicionalmente, se obtuvieron los sgRNA para las proteínas Mnn9 y Ecm33 y el constructo del plásmido pV1382 para la construcción de mutantes mediante el sistema CRISPR-Cas9. 9 Conclusiones: El entendimiento de la dinámica de la pared celular en presencia de fármacos permite una mejor comprensión de la adaptación al estrés generado por estos, en este estudio se encontró que las manoproteínas tienen un rol importante en la respuesta a caspofungina, se observó que la deleción de genes implicados en la biosíntesis de manoproteínas en S. cerevisiae condujo a disminución de la CMI, además en C. glabrata la inhibición de la vía de la N-glicosilación en combinación con caspofungina logró disminuir la CMI en aislados resistentes. Resultados que en conjunto son prometedores pues evidencian que la ausencia de manoproteínas en la pared celular afecta el crecimiento de la levadura, sin embargo, es necesario continuar el estudio en C. glabrata para validar los resultados.Introduction: IFD (Invasive fungal disease) have increased in recent years as a result of the increase of immunocompromised patients, being of particular interest those caused by the yeast C. glabrata (second most prevalent species in the world causing candidemia), because it is with high frequency resistant to azoles and with a significant increase to echinocandins, causing therapeutic failures and high mortality rates. For this reason, the search for new therapeutic targets is relevant; one of the strategies to identify possible targets is the study of essential proteins involved in the response to drugs. Objective: This study aimed to evaluate the effect of the deletion or inhibition of proteins involved in cell wall biosynthesis in response to different stress conditions Methodology: Haploinsufficient mutants of S. cerevisiae for 15 proteins involved in cell wall biosynthesis were evaluated against the drugs caspofungin, fluconazole and against different types of stress (thermal, osmotic, oxidative, cell wall disrupting agents and inhibition of the CaM/CaL pathway), in addition, the susceptibility of C. glabrata to the N-glycosylation inhibitor TM (Tunicamycin) alone and in combination with caspofungina was determined. Finally, based on the results obtained in S. cerevisiae, 2 proteins were chosen for the bioinformatic design of the CRISPR-Cas9 system in order to evaluate the phenotype of the mutants in clinical isolates of resistant C. glabrata. Results: It was found that the deletion of genes associated with mannoprotein biosynthesis leads to a decrease in MIC (Minimum Inhibitory Concentration) in the presence of caspofungin, and that GPI-type proteins are important in the response to fluconazole; on the other hand, the depletion of any of the genes involved in the biosynthesis or formation of the cell wall generates yeasts with greater susceptibility to cell wall disruptors. It was identified that the GPI-anchored protein Ecm33 participates in the response to most of the conditions evaluated and that the CaM/CaL signaling pathway is important in the response to fluconazole and TM. On the other hand, the combination of TM and caspofungin was able to decrease the MIC in resistant C. glabrata isolates. Additionally, sgRNAs for Mnn9 and Ecm33 proteins and the plasmid construct pV1382 were obtained for mutant construction using the CRISPR-Cas9 system. Conclusions: Understanding cell wall dynamics in the presence of drugs allows a better understanding of adaptation to drug-generated stress, in this study mannoproteins were found to play an important role in the response to caspofungin, it was observed that deletion of genes involved in mannoprotein biosynthesis in S. cerevisiae led to decreased MIC, furthermore in C. glabrata inhibition of the N-glycosylation pathway in combination with caspofungin was able to decrease MIC in resistant isolates. Taken together, these results are promising because they show that the absence of mannoproteins in the cell wall affects yeast growth; however, it is necessary to continue the study in C. glabrata to validate the results.Bacteriólogo (a)Pregrad