Engineering a Cas9-monomeric Streptavidin Fusion to Increase CRISPR Knock-in Efficiency In Vitro

The discovery of the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), a bacterial adaptative defence system, was one of the major recent biotechnological breakthroughs, which has revolutionized gene editing in several fields. This system can be artificially manipulated to guide a Cas9 endonuclease with a single guide RNA (sgRNA) to regions of interest in the genome of a given cell. When a target sequence is recognized, Cas9 inserts a double-strand break that triggers the DNA repair of that region by either the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) or the error-free, template-dependent, homology-directed repair (HDR) pathway. To increase the local concentration of the template DNA, skewing the repair to the HDR pathway, a Cas9 fused to a monomeric streptavidin (MSA) has been used, which was tethered to a biotinylated template DNA, thus increasing the efficiency of repair. In this thesis, two-point mutations - S14R and T39W, hypothesized to increase streptavidin's affinity to biotin - were inserted into the MSA gene of the Cas9-MSA-encoding plasmid. The engineered Cas9-MSA** plasmid, as well as the original Cas9-MSA and Cas9-wild-type (WT) plasmids, were used to transfect DR-GFP cells and were shown to have comparable HDR activities. Furthermore, with the addition of an exogenous template to the transfection conditions, the mutated Cas9-MSA produced the highest number of HDR-caused events with the biotinylated template, with a 1.3-fold increase of effi-ciency when compared to the original Cas9-MSA, and a 2.1-fold increase when compared to the tradi-tional Cas9-WT system. These results are encouraging to explore this field of research further and im-prove the CRISPR-Cas9 technique to reach the required efficacy and safety for gene therapy applica-tions.A descoberta em bactérias do sistema de defesa adaptativo Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) foi um dos principais recentes avanços biotecnológicos, pois revolucionou a edição genética em diferentes campos. Este sistema pode ser artificialmente manipulado para direcionar uma endonuclease Cas9 com um RNA guia (sgRNA) para regiões de interesse no genoma de uma determinada célula. Quando uma sequência-alvo é reconhecida, a Cas9 insere uma quebra de cadeia dupla que desencadeia a reparação do DNA dessa região, através de non-homologous end joining (NHEJ) - propensa a erros - ou de homology-directed repair (HDR) - sem erros e dependente de um molde. Para aumentar a concentração local do molde de DNA, melhorarando a eficiência de reparação por HDR, foi utilizada uma Cas9 fundida a uma streptavidina monomérica (MSA), a qual foi ligada a um molde de DNA biotinilado, deste modo aumentando a eficiência da reparação. Nesta tese, duas mutações pontuais - S14R e T39W - foram inseridas no gene MSA do plasmídeo que codifica para a Cas9-MSA, com a hipótese de aumentar a afinidade da streptavidina para a biotina. O plasmídeo modificado Cas9-MSA**, assim como os plasmídeos de Cas9-MSA original e de Cas9-wild-type (WT), foram utilizados para transfetar células DR-GFP, e mostraram atividades de HDR semelhantes. Com a adição de um molde exógeno às condições de transfeção, a Cas9-MSA mutada produziu o maior número de eventos causados por HDR com o molde de DNA biotinilado, com um aumento de eficiência de 1.3 vezes quando comparado com a Cas9-MSA original, e de 2.1 vezes quando comparado com o sistema tradicional de Cas9-WT. Estes resultados são encorajadores para explorar esta área de investigação e melhorar a técnica de CRISPR-Cas9, para que possa possuir a eficácia e segurança necessárias para aplicações em terapia genética