Interrogating the energy conservation of Clostridium ljungdahlii by genetic manipulation and bench-scale fermentation

Acetogene Bakterien haben ein großes Potenzial für den Einsatz in einer modernen und nachhaltig-orientierten Industrie, um gasförmige Substrate wie Kohlenmonoxid (CO), Kohlendioxid (CO2) und Wasserstoff (H2) in wertvolle Biochemikalien umzuwandeln. Die Gasfermentation mit acetogenen Bakterien hat nur einen geringen oder sogar negativen CO2-Fußabdruck und bietet damit eine interessante Alternative zu bestehenden petro-chemischen Produktionswegen. Die Hauptprodukte der acetogenen Gasfermentation sind Acetat und Ethanol, wobei letzteres direkt als Biokraftstoff verwendet werden kann. Kommerzielle Gasfermentationsanlagen mit acetogenen Bakterien werden bereits von der Firma Lanzatech betrieben, was die industrielle Relevanz dieser Technologie unterstreicht. Obwohl acetogene Bakterien als vielversprechende Biokatalysatoren gelten, ist ihr Energiestoffwechsel jedoch stark limitiert. Die Hauptwährung des Energiestoffwechsels innerhalb einer Bakterienzelle ist ATP. Dieses ATP wird für das Zellwachstum und für viele weitere Stoffwechselwege benötigt, z.B. auch für solche die zur Herstellung wertvoller und industriell relevanter Produkte genutzt werden. Alle bekannten acetogenen Bakterien nutzen den Wood-Ljungdahl pathway (WLP) zur Fixierung von Kohlenstoff. Der WLP hat jedoch keinen Netto-ATP-Gewinn. Ein Mol ATP wird investiert, um CO2 zu fixieren, während ein Mol ATP durch die Dephosphorylierung von Acetylphosphat zu Acetat regeneriert wird. Die einzige Möglichkeit, wie ein acetogenes Bakterium unter autotrophen Bedingungen zusätzliches ATP erzeugen kann, basiert auf Membrankomplexen wie dem Rhodobacter Nitrogen Fixation-like complex (RNF-Komplex). Dieser Komplex erzeugt einen Protonen- oder Natriumionengradienten über die Bakterienmembran, der dann von einer ATPase zur Erzeugung von ATP genutzt wird. Der ATP-Gewinn dieses chemiosmotischen Mechanismus ist jedoch ebenfalls gering. So kann das acetogene Bakterium Clostridium ljungdahlii beim Wachstum mit H2 und CO2 maximal 0.63 ATP/mol H2 erzeugen. Diese geringe Menge an ATP reicht gerade aus, um Wachstum und einen funktionierenden Grundstoffwechsel zu ermöglichen. Einerseits ist der geringe ATP-Gewinn ein Vorteil für die mikrobielle Biokraftstoffproduktion, da die Elektronen überwiegend für das Produkt und nicht für die Biomasse verwendet werden. Andererseits ist die Energiebeschränkung bei acetogenen Bakterien eine der größten Hürden, die es zu überwinden gilt, da diese maßgeblich die Produktion hochwertiger und ATP-fordernder Fermentationsprodukte einschränkt. Diese sind aber für eine breite Anwendung der Gasfermentation mit acetogenen Bakterien in der Industrie erforderlich, wodurch weitere Forschung mit diesen Mikroben notwendig ist. In dieser Dissertation wird der RNF-Komplex des acetogenen Bakteriums C. ljungdahlii und sein Einfluss auf den autotrophen Energiestoffwechsel untersucht. Für die genetische Manipulation von Genen, die mit dem RNF-Komplex und dem Energiestoffwechsel assoziiert sind, wurde eine CRISPR-Cas12a-Plasmid-Technik entwickelt und eingesetzt. Hiermit wurde erstmals eine vollständige Deletion der gesamten RNF-Komplex-Gene in C. ljungdahlii erreicht, welche die essenzielle Rolle dieses Komplexes für die Autotrophie bestätigte. Darüber hinaus konnte durch die Manipulation des Gens rseC, welches eine entscheidene Rolle in der transkriptionellen Kontrolle der RNF-Komplex-Genexpression spielt, ein neuer und bisher unbekannter Faktor für einen funktionellen RNF-Komplex in C. ljungdahlii aufgedeckt werden. Zudem liegt ein weiterer Fokus dieser Dissertation auf dem Nitrat-Stoffwechsel von C. ljungdahlii. Dieser wurde erst kürzlich beschrieben und ist auf noch nicht vollständig aufgeklärter Weise eng mit dem Energiestoffwechsel verbunden. Wenn Nitrat zusammen mit CO2 verwertet wird, entsteht zusätzliches ATP für den Metabolismus. Die potenzielle Nutzung dieses erhöhten ATP-Pools wird mit der Implementierung eines Stoffwechselwegs zur Produktion des Biopolymers Cyanophycin in dieser Dissertation angesprochen. Cyanophycin besteht hauptsächlich aus den Aminosäuren Arginin und Aspartat und könnte ein interessantes Vorstufenprodukt für die Lebensmittel- und Futtermittelindustrie sein. Des Weiteren wurden neue Erkenntnisse durch die Untersuchung der Nitratreduktion in selbstgebauten Bioreaktoren gewonnen. Bioreaktorexperimente mit acetogenen Bakterien sind essenziell, um das mikrobielle Verhalten unter kontrollierten Bedingungen, wie z.B. pH-Kontrolle, kontinuierliche Begasung oder kontinuierliche Mediumzufuhr, zu untersuchen. Experimentelle Daten aus Bioreaktoren sind ein wesentlicher Schritt für den Skalierungsprozess der Gasfermentation von acetogenen Bakterien und damit ein Schlüsselfaktor für die Anwendbarkeit dieser Technologie.Acetogenic bacteria have great potential for the use in modern industries to convert gaseous substrates, such as carbon monoxide (CO), carbon dioxide (CO2), and hydrogen (H2) into valuable biochemicals. Gas fermentation with acetogenic bacteria provides an alternative route with a reduced CO2 footprint when compared to existing petrochemical-based production processes. The main products of the acetogenic gas fermentation are acetate and ethanol, with the latter being a drop-in biofuel. Commercial gas fermentation plants with acetogenic bacteria are operated by the company Lanzatech, which underlines the industrial relevance of this technology. Although acetogenic bacteria are promising biocatalysts, their general metabolism is suffering from energy limitations. The main currency of the energy metabolism of a bacterial cell is ATP. The ATP is required for cell growth and for many metabolic pathways, such as those that can be used to produce valuable and industrial relevant products. All known acetogenic bacteria use the Wood-Ljungdahl pathway (WLP) to fix carbon. However, the WLP has no net ATP gain. One mole of ATP is invested to fix CO2, while one mole of ATP is regenerated through dephosphorylation of acetyl phosphate to acetate. The only way an acetogenic bacterium can acquire surplus ATP during autotrophy is based on membrane complexes such as the Rhodobacter Nitrogen Fixation-like complex (RNF complex). This complex generates a proton or sodium ion gradient across the bacterial membrane, which is then used by an ATPase to generate ATP. However, the ATP gain of this chemiosmotic mechanism is low. For instance, the acetogenic bacterium Clostridium ljungdahlii can generate a maximum of 0.63 ATP/mol H2 when growing with H2 and CO2. This small amount of ATP is just enough to enable growth and a functional metabolism. On the one hand, the low ATP gain is an advantage for biofuel production because electrons are predominantly used for the product rather than for biomass. On the other hand, the energy limitation in acetogenic bacteria is one of the highest burdens to overcome, and still limits the production of high-value and ATP-demanding fermentation products, which are required for a broad application of the acetogenic gas fermentation in industry. Therefore, more research with these microbes is highly required. This dissertation investigates the RNF complex of the acetogenic bacterium C. ljungdahlii and its impact on autotrophic energy metabolism. A CRISPR-Cas12a technique was developed and used for the genetic manipulation of genes that are associated with the RNF complex and the energy metabolism. A full deletion of all RNF complex genes was achieved in C. ljungdahlii for the first time and confirmed the essential role of this complex for autotrophy. Furthermore, the manipulation of the gene rseC, which has a potential role in the transcriptional control of the RNF-complex gene expression, unraveled a novel and unknown factor for a functional RNF complex in C. ljungdahlii. In addition, this dissertation focuses on nitrate metabolism of C. ljungdahlii, which was recently characterized in detail. Nitrate reduction in C. ljungdahlii is tightly connected to energy metabolism. The mechanism behind this is not understood yet. However, when C. ljungdahlii co-utilizes nitrate and CO2, more ATP is generated and available for its metabolism. The potential use of this increased ATP pool is addressed with the implementation of a pathway to produce the biopolymer cyanophycin. Cyanophycin mainly consists of the amino acids arginine and aspartate and might be a suitable precursor for the feed and food industry. In addition, new insights were made by studying the nitrate reduction of C. ljungdahlii in self-built bioreactors. Bioreactor experiments with acetogenic bacteria are essential to investigate the microbial behavior under controlled conditions (e.g., pH-control, continuous gassing, continuous medium feed). Experimental data from bioreactor experiments are one critical step for the upscaling process of gas fermentation of acetogenic bacteria, and therefore a key factor to show the applicability of this technology