Analysis of the selected polyphenols by LC-MS method

Celem pracy były pilotażowe badania nad opracowaniem metody analitycznej dla oznaczeń dwóch polifenoli: kwercetyny oraz trans-rezweratrolu w materiale biologicznym przy użyciu nowo zakupionego urządzenia UPLC-MS/MS firmy Waters Corp., USA. Badania obejmowały ustalenie optymalnych przejść masowych w procesie fragmentacji jonowej dla jakościowej identyfikacji oznaczanych związków i zoptymalizowanie parametrów kwadrupolowego analizatora masowego dla oznaczeń ilościowych analitów. Istotnym celem badań był również wybór dogodnego wzorca wewnętrznego (IS) w przyjętych warunkach oznaczeń. Przy pomocy opracowanej metody podjęto próbę oznaczenia ilościowego kwercetyny oraz trans-rezweratrolu w próbkach wątrób szczurów eksponowanych na badane związki w odrębnym eksperymencie oceniającym efekty neuroprotekcyjne polifenoli w podprzewlekłym narażeniu na glin. Oczyszczanie próbek przeprowadzono metodą strącania białka przy użyciu acetonitrylu. Analiza chromatograficzna przeprowadzona została z zastosowaniem 0,1 % kwasu mrówkowego w wodzie oraz 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu jako fazy ruchomej. Rozdział chromatograficzny badanych związków wykonano na kolumnie Acquity UPLC BEH C18 (1.7 μm, 2.1 x 50 mm) z zastosowaniem elucji gradientowej. Czasy retencji oznaczanych związków mieściły się w zakresie 1,39-1,51. Wyznaczono krzywą kalibracyjną dla kwercetyny w zakresie stężeń 0,1 – 2,5 μg/ml, a współczynnik korelacji wynosił 0,9900. We wszystkich próbkach badanych stężenie kwercetyny znajdowało się poniżej LOQ. Dla rezweratrolu nie udało wyznaczyć się krzywej kalibracyjnej dlatego nie podjęto próby oznaczenia ilościowego w próbkach badanych wątrób szczurów. Opracowana w niniejszej pracy metoda wymaga dalszej optymalizacji przygotowywania próbek do oznaczeń oraz dalszych etapów walidacji w celu możliwości zastosowania jej do oznaczeń ilościowych i jakościowych trans-rezweratrolu oraz kwercetyny w próbkach biologicznych.The aim of the study was to conduct a pilot study on the development of an analytical method for the determination of two polyphenols: quercetin and trans-resveratrol in biological material using a newly purchased UPLC-MS / MS device from Waters Corp., USA. The research included the determination of the optimal mass transitions in the ion fragmentation process for the qualitative identification of the tested compounds and the optimization of the parameters of the quadrupole mass analyzer for the quantification of analytes. An important aim of the research was also the selection of a convenient internal standard (IS) in the assumed conditions of determinations. With the help of the developed method, an attempt was made to quantify quercetin and trans-resveratrol in the samples, livers of rats exposed to the tested compounds in a separate experiment assessing the neuroprotective effects of polyphenols in sub-chronic exposure to aluminum. Sample purification was performed by protein precipitation using acetonitrile. The chromatographic analysis was performed using 0.1% formic acid in water and 0.1% formic acid in acetonitrile as mobile phase. Chromatographic separation of test compounds was performed on an Acquity UPLC BEH C18 column (1.7 µm, 2.1 x 50 mm) using gradient elution. The retention times of the tested compounds ranged from 1.39-1.51. A calibration curve was established for quercetin in the concentration range of 0.1 - 2.5 μg / ml, and the correlation coefficient was 0.9900. In all samples tested, the quercetin concentration was below the LOQ. For resveratrol, no calibration curve could be determined, therefore no attempt was made to quantify the samples of the tested rat livers. The method developed in this paper requires further optimization of sample preparation for determinations and further stages of validation in order to be able to apply it for quantitative and qualitative determinations of trans-resveratrol and quercetin in biological samples