Development and validation of a method for the determination of fatty acids using LC/MS/MS

Celem pracy było opracowanie metody jednoczesnego oznaczania wybranych trzydziestu dwóch kwasów tłuszczowych z zastosowaniem ultrasprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC/MS/MS) oraz określenie zakresu liniowości dla próbek sporządzonych w sztucznym osoczu. Przedmiotem badań były związki z trzech rodzin, tj. kwasów tłuszczowych nasyconych, jednonienasyconych oraz wielonienasyconych. Do oczyszczania próbek wybrano metodę strącania białka odczynnikiem organicznym, stosując metanol, jako czynnik strącający. Dla porównania przeprowadzono także oczyszczanie próbek metodą ekstrakcji typu ciecz-ciecz z odparowaniem rozpuszczalnika w atmosferze azotu. Przeprowadzono optymalizację parametrów detekcji masowej oraz analizy chromatograficznej. Analizę chromatograficzną prowadzono początkowo stosując mieszaninę metanolu i wody z dodatkiem 1% roztworu octanu amonu, jako akceptora protonów. Następnie fazę ruchomą zmieniono na mieszaninę acetonitrylu i wody z dodatkiem 1% octanu amonu. Rozdzielenie chromatograficzne badanych związków wykonano na kolumnie Acquity UPLC BEH C18 (1.7 µm, 2.1 x 50 mm) z zastosowaniem elucji gradientowej. Uzyskano rozdzielenie analitów w czasie mniejszym niż cztery minuty. Czasy retencji oznaczanych kwasów mieściły się w wąskim zakresie od 2,46 do 3,36 minut. Liniową zależność odpowiedzi detektora od stężenia analitów wyznaczono według wytycznych FDA. Dla wszystkich związków wyznaczono krzywą kalibracyjną w zakresie stężeń 0,625-10,00 µg/ml. Zadowalającą liniowością charakteryzowały się kwasy jednonienasycone i wielonienasycone, dla których współczynniki korelacji mieściły się w zakresie 0,9436 - 0,9989. Kwasy tłuszczowe nasycone z wyjątkiem kwasu nonadekanowego nie wykazały liniowości, prawdopodobnie z powodu nieodpowiedniej metody oczyszczania próbek. Opracowana metoda wymaga dopracowania procesu przygotowywania próbek oraz przeprowadzenia dalszych etapów walidacji, w celu umożliwienia jej zastosowania do oznaczeń jakościowych i ilościowych kwasów tłuszczowych w próbkach biologicznych.The aim of this study was to develop a method for the simultaneous determination of selected thirty-two fatty acids using ultra high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) and to determine the range of linearity for samples prepared in artificial plasma. The subjects of the study were compounds from three families: saturated, monounsaturated and polyunsaturated fatty acids. For purification of the samples the method of protein precipitation with an organic reagent was chosen, using methanol as a precipitating agent. For comparison, purification of samples by liquid-liquid extraction with solvent evaporation under nitrogen atmosphere was also carried out. Optimization of mass detection and chromatographic analysis parameters was carried out. Chromatographic analysis was initially carried out using a mixture of methanol and water with the addition of 1% ammonium acetate as a proton acceptor. Then the mobile phase was changed to a mixture of acetonitrile and water with the addition of 1% ammonium acetate. Chromatographic separation of the studied compounds was performed on an Acquity UPLC BEH C18 column (1.7 µm, 2.1 x 50 mm) using gradient elution. Separation of analytes was achieved in less than four minutes. The retention times of the acids were within a narrow range of 2.46 to 3.36 minutes. The linear dependence of detector response on analyte concentrations was determined according to FDA guidelines. A calibration curve was established for all compounds using samples in the concentration range of 0.625-10.00 µg/ml. Monounsaturated and polyunsaturated fatty acids showed satisfactory linearity, with correlation coefficients in the range 0.9436 - 0.9989. Saturated fatty acids with the exception of nonadecanoic acid did not show linearity, probably due to the mismatched sample purification method. The developed method requires refinement of the sample preparation process and further validation steps to enable its application to the qualitative and quantitative determination of fatty acids in biological samples