Peripheral blood mononuclear cells are hypomethylated in active rheumatoid arthritis and methylation correlates with disease activity

Objective: Epigenetic modifications are dynamic and influence cellular disease activity. The aim of this study was to investigate global DNA methylation in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of RA patients to clarify whether global DNA methylation pattern testing might be useful in monitoring disease activity as well as the response to therapeutics. Methods: Flow cytometric measurement of 5-methyl-cytosine (5'-mC) was established using the cell line U937. In the subsequent prospective study, 62 blood samples were investigated, including 17 healthy donors and 45 RA patients at baseline and after 3 months of treatment with methotrexate, the IL-6 receptor inhibitor sarilumab, and Janus kinase inhibitors. Methylation status was assessed with an anti-5'-mC antibody and analysed in PBMCs and CD4+, CD8+, CD14+ and CD19+ subsets. Signal intensities of 5'-mC were correlated with 28-joint DASs with ESR and CRP (DAS28-ESR and DAS28-CRP). Results: Compared with healthy individuals, PBMCs of RA patients showed a significant global DNA hypomethylation. Signal intensities of 5'-mC correlated with transcription levels of DNMT1, DNMT3B and MTR genes involved in methylation processes. Using flow cytometry, significant good correlations and linear regression values were achieved in RA patients between global methylation levels and DAS28-ESR values for PBMCs (r = -0.55, P = 0.002), lymphocytes (r = -0.57, P = 0.001), CD4+ (r = -0.57, P = 0.001), CD8+ (r = -0.54, P = 0.001), CD14+ (r = -0.49, P = 0.008) and CD19+ (r = -0.52, P = 0.004) cells. Conclusions: The degree of global DNA methylation was found to be associated with disease activity. Based on this novel approach, the degree of global methylation is a promising biomarker for therapy monitoring and the prediction of therapy outcome in inflammatory diseases.Zielsetzung Die DNA-Methylierung, als wichtiger epigenetischer Regulator, ist dynamisch, reversibel und beeinflusst den Verlauf der rheumatoiden Arthritis (RA). Die Studie konzentriert sich auf die globale DNA-Methylierung in peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) von Patienten mit RA, um festzustellen, ob die Prüfung des globalen DNA-Methylierungsmusters für die Überwachung der Krankheitsaktivität und für das Ansprechen auf Therapeutika genutzt werden kann. Methoden In dieser prospektiven, experimentellen Studie wurden Blutproben von 29 Patienten mit RA untersucht und mit einer Kontrollkohorte von 17 gesunden Spendern verglichen. Der Methylierungsstatus wurde mit einem anti-5'-Methylcytosin Antikörper (anti-5'-mC) bestimmt und in PBMCs, sowie über ‘Cluster of differentiation‘ (CD)4+-, CD8+-, CD14+- und CD19+- Zellmessungen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Signalintensitäten der Methylierungsmessung wurden mit den Werten des klinisch relevanten Disease Activity Score 28 (DAS28-BSG, DAS28-CRP) korreliert. Blutproben von RA-Patienten wurden vor Studienbeginn und nach drei Monaten Behandlung mit dem DMARD Methotrexat, dem biologischen DMARD Sarilumab oder mit Janus-Kinase-Inhibitoren (JAKinibs) entnommen. Darüber hinaus wurden die Transkriptionsniveaus von Genen, die an Methylierungsprozessen beteiligt sind, mit dem Grad der 5'-mC Methylierungsstärke korreliert. Das Protokoll wurde mit der Modell-Zelllinie U937 etabliert. Ergebnisse Im Vergleich zu gesunden Spendern zeigten PBMCs und ihre Subtypen von RA-Patienten eine signifikante globale DNA-Hypomethylierung. Korrelationen zwischen der 5'-mC-Signalintensität und den DAS28-BSG Werten wurden für Lymphozyten (r=-0,57), CD4+ (r=-0,57), CD8+ (r=-0,54), CD14+ (r=-0,49) und CD19+ (r=-0,52) Zellsubpopulationen berechnet. Die Signalintensitäten der 5´-mC-Messungen zeigten eine gute Korrelation mit den Transkriptionsniveaus der DNA-Methyltransferasen Gene DNMT1 (r=0,57), DNMT3B (r=0,53), dem Gen für die 5-Methyltetrahydrofolat-Homocystein Methyltransferase (MTR; r=0,46) und in geringerem Maße mit dem Gen der Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase (MTHFR; r=0,39). Die relative Anzahl der Zellzahlen zu Beginn und nach drei Monaten Behandlung zeigte dabei eine Abnahme der Lymphozyten (-5,3%) und CD4+-Zellen (-3,2%), während die Anzahl der anderen Zellsubpopulationen unverändert blieb. Schlussfolgerungen Unsere Studie zeigt einen Zusammenhang zwischen dem Methylierungsverhalten von PBMCs und ihren Blutzell-Subtypen und der Krankheitsaktivität bei Patienten mit RA. Basierend auf durchflusszytometrischen Messungen kann der Grad der globalen Methylierung ein vielversprechender Biomarker für die Therapieüberwachung und die Prognose des Therapieerfolgs bei entzündlichen Erkrankungen sein