Mechanistische und evolutionäre Aspekte der Glutathionperoxidase 4 (Gpx4)

Die Glutathionperoxidase 4 (Gpx4) zählt zur Enzymfamilie der Glutathionperoxidasen (Gpx). Diese Proteine reduzieren organische und anorganische Hydroperoxide zu deren jeweiligen Hydroxiden. Charakteristischerweise verfügen die Enzyme der Gpx-Familie über eine Cystein (Cys, C)- bzw. Selenocystein (Sec, U)-basierte katalytische Tetrade (C/U, Glutamin (Gln, Q), Tryptophan (Trp, W), Asparagin (Asn, N)). Als eines von drei monomeren Proteinen der menschlichen Gpx-Familie ist die Gpx4 in der Lage komplexe Lipidhydroperoxide zu reduzieren. In reifen Spermien fungiert das Protein dagegen als Strukturelement. Umfangreiche Untersuchungen zur Evolution der Gpx4 fehlen bisher. In Folge einer Genomduplikation verfügt der Zebrafisch, ein gängiger Modellorganismus, über zwei paraloge gpx4-Gene (zfgpx4a, zfgpx4b). Beide zfgpx4-Gene kodieren für funktionelle Selenoproteine, die bislang kaum charakterisiert wurden. Im Rahmen dieser Dissertationsschrift erfolgte eine Datenbankrecherche, bei der die Reference Sequence (RefSeq)-Sammlung des National Center for Biotechnology Information (NCBI) mittels BLAST auf das Vorkommen von Gpx4-ähnlichen Proteinsequenzen durchsucht wurde. Obwohl solche Sequenzen in allen drei Domänen des Lebens und auch bei Viren identifiziert werden konnten, fand sich im Großteil der irdischen Lebewesen (> 90 %) keine Gpx4-ähnliche Sequenz. Diese geringe Verbreitungshäufigkeit trifft auch auf Säugetiere zu, bei denen etwa 10 % aller hinterlegten Säugetierspezies Gpx4-ähnliche Sequenzen enthielten. Niedere Lebensformen wiesen überwiegend katalytische Tetraden mit CQWN auf. Bei Wirbeltieren waren Enzyme mit vorwiegend UQWN-Tetrade nachweisbar. Zusammenfassend scheint irdisches Leben auch ohne Gpx4-ähnlichem Enzym möglich. Ein früher postuliertes hypothetisches Gpx4-Urgen müsste im Laufe der Evolution in einer Vielzahl von Organismen verloren gegangen sein. Für funktionelle Untersuchungen wurden die beiden Gpx4-Paraloge des Zebrafisches (zfGpx4a Isoform 2, zfGpx4b) als Cys- und Sec-Proteine in E. coli rekombinant exprimiert. Verglichen mit dem Sec-Enzym wiesen die Cys-Proteine eine extrem geringe katalytische Aktivität auf. Trotz ähnlicher Temperatur- und pH-Profile zeigten beide Isoformen deutliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Substratspezifität. Während die zfGpx4a auch bei 37 °C hohe katalytische Aktivitäten mit Phosphatidylcholin-Hydroperoxid (PC-OOH) aufwies, war die PC-OOH-Aktivität der zfGpx4b deutlich reduziert. Um die beiden zfGpx4-Paraloge auf mögliche N-terminale Proteinsortierungssignale zu untersuchen, wurden COS7-Zellen mit Transfektionsplasmiden transfiziert, die neben den potentiellen Sortierungssequenzen die Kodierungssequenzen für verschiedene Fluoreszenzproteine beinhalteten. Bei der zfGpx4b konnten deutliche Fluoreszenzsignale in den Mitochondrien nachgewiesen werden. Expressionsanalysen der zfgpx4-mRNA während der Zebrafischentwicklung erfolgten mittels Real-Time-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) und zeigten zeitlich, dynamische Expressionmuster. In Zusammenschau scheint es in Folge der Genomduplikation zu einer funktionellen Spezialisierung der beiden zfGpx4-Isoformen gekommen zu sein, aus der heraus sich das „Überleben“ des gpx4-Paraloges im Zebrafisch begründen lassen könnte.Glutathione peroxidase 4 (Gpx4) belongs to the family of glutathione peroxidases (Gpx). These proteins reduce organic and anorganic hydroperoxides to the corresponding hydroxides. Typically, enzymes of the gpx-family contain a cysteine (Cys, C) or selenocysteine (Sec, U) based catalytic tetrad (C/U, glutamine (Gln, Q), tryptophane (Trp, W), asparagine (Asn, N)). Gpx4 is one of three monomeric human gpx-enzymes and capable of reducing complex lipid hydroperoxides. However, Gpx4 acts as a structural component in mature spermatozoa. To date, comprehensive studies on Gpx4 evolution are lacking. Zebrafish is a known model organism. Due to a genome duplication zebrafish exhibits two different gpx4-gene paralogs (zfgpx4a, zfgpx4b). Both encode functional selenoproteins which are scarcely characterised so far. We performed an in silico search and studied the occurrence of Gpx4-like protein sequences in the Reference Sequence (RefSeq)-assemblage of the National Center of Biotechnology Information (NCBI) via BLAST. Although we identified such sequences in all three domains of terrestrial life and even in viruses, the majority of living organism (> 90 %) does not encode Gpx4-like sequences. This low frequency of occurence even applies to mammals. About 10 % of mammalian species exhibit Gpx4-like sequences. In lower living organism we predominantly observed catalytic tetrads with CQWN. In contrast, vertebrates mostly contain proteins with UQWN tetrad. To conclude, terrestrial life seems to be possible without Gpx4-like enzymes. A formerly postulated ancient Gpx4-gene must have been lost during the time course of evolution in numerous organism. To conduct functional characterisations we performed recombinant protein expression of both zebrafish Gpx4-paralogs (zfGpx4a isoform 2, zfGpx4b) in E. coli and expressed Cys- and Sec-proteins. Unlike Sec-enzymes, Cys-proteins displayed extremely low catalytic activity. Although similar in their temperature- and pH-profile both isoforms differed in their substrate specifity. While zfGpx4a also exhibited high catalytic activity for phosphatidylcholin-hydroperoxide (PC-OOH) at 37 °C, zfGpx4b showed only minor catalytic PC-OOH-activity. To investigate whether both zfGpx4-isoforms contain a potential protein sorting signal, we transfected COS7-cells with transfection plasmids which consisted of coding sequences for potential sorting signals and fluorescent proteins. For zfGpx4b, fluorescent signals associated to mitochondria were observed. Expression of zfgpx4-mRNA were analysed via real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and revealed dynamic expression patterns during zebrafish development. Summing up, it seems as if zfGpx4-isoforms have functionally differentiated after genome duplication which migth be the cause of the „survival“ of gpx4-paralog in zebrafish