Bacteriophages as an alternative strategy in the treatment and prevention of implant-associated infections

Bacterial biofilms growing on surfaces are highly refractory to the conventional antimicrobial therapy. Complete eradication of the biofilm consists of invasive surgical intervention combined with prolonged systemic antimicrobial administration. Hence, the development of new and alternative strategies to fight chronic implant-associated infections gained increasing interest. Due to their antimicrobial properties, bacteriophages have been revalued as a promising agents to treat bacterial implant-associated infections, especially related to multidrug resistant bacteria. The aim of this work was to investigate the antimicrobial activity of different bacteriophages, alone or in combination with conventional antibiotics as alternative approach, in order to improve the treatment of mono and dual-species implant-associated infections. Results revealed the wide potential of isothermal microcalorimetry (IMC) for screening and evaluating bacteriophage activity to predict a treatment success on demand for biofilm infections. Moreover, different methods such as sonication, confocal laser scanning and scanning electron microscopy were combined for the evaluation of anti-biofilm activities of bacteriophages. Higher phage titers and longer exposure of bacteriophages were required to kill biofilm bacteria in comparison with planktonic counterparts. However, in the experiments of biofilm prevention, our IMC results presented that the heat production was abolished in the presence of subinhibitory titers of phages within 24 hours. Additionally, tested phage formulations increased the survival of Galleria mellonella larvae Staphylococcus aureus infection compared to untreated control. We also determined that conventional antibiotics had high minimum biofilm eradicating concentration (MBEC) values (ranging from 128 to >4096 µg/mL) when investigated alone against biofilms. The co-administration of phages with antibiotics improved considerably the antibiotic efficacy against mono and dual-species biofilm, especially after staggered exposure, strongly reducing the MBEC values. Interestingly, staphylococcal bacteriophage Sb-1 demonstrated a dose-dependent reduction of the exopolysaccharide matrix, whereas PYO bacteriophage had no effect, suggesting that some phages could enhance the penetration of antibiotics to the deeper layers of biofilms. This work also showed that even lower Sb-1 phage titers can kill phage-treated Staphylococcus aureus-persistent cells, when metabolically inactive cells were inoculated in fresh medium and returned to a normally growing phenotype. Overall, this thesis generates new insights for preventing implant colonization and killing biofilm bacteria attached on a surface. Further pre-clinical and clinical trials are needed towards their clinical application.Bakterielle Biofilme, die auf Oberflächen wachsen, sind gegenüber der konventionellen antimikrobiellen Therapie sehr refraktär. Die vollständige Eradikation des Biofilms besteht aus einem invasiven chirurgischen Eingriff in Kombination mit einer längeren systemischen antimikrobiellen Verabreichung. Daher gewann die Entwicklung neuer und alternativer Strategien zur Bekämpfung chronischer implantatassoziierter Infektionen zunehmend an Interesse. Aufgrund ihrer antimikrobiellen Eigenschaften wurden Bakteriophagen als vielversprechende Agent zur Behandlung bakterieller implantat-assoziierter Infektionen, insbesondere im Zusammenhang mit multiresistenten Bakterien, neu bewertet. Ziel dieser Arbeit war es, die antimikrobielle Aktivität verschiedener Bakteriophagen, allein oder in Kombination mit konventionellen Antibiotika als alternativen Ansatz, zu untersuchen, um die Behandlung von Mono- und Dual-Spezies-Implantat-assoziierten Infektionen zu verbessern. Die Ergebnisse zeigten das breite Potenzial der isothermen Mikrokalorimetrie (IMK) für das Screening und die Bewertung der Aktivität von Bakteriophagen zur Vorhersage eines Behandlungserfolgs bei Biofilm-Infektionen auf Nachfrage. Darüber hinaus wurden verschiedene Methoden wie Sonikation, konfokales Laserscanning und Rasterelektronenmikroskopie kombiniert, um die Anti-Biofilm-Aktivitäten von Bakteriophagen zu bewerten. Höhere Phagentiter und eine längere Exposition der Bakteriophagen waren erforderlich, um Biofilm- Bakterien im Vergleich zu planktonischen Pendants abzutöten. In den Experimenten zur Biofilm-Prävention zeigten unsere IMK-Ergebnisse jedoch, dass die Wärmeproduktion in Gegenwart von subinhibitorischen Titern von Phagen innerhalb von 24 Stunden aufgehoben wurde. Darüber hinaus erhöhten getestete Phagenformulierungen die Überlebensrate einer Infektion mit Galleria mellonella Larven Staphylococcus aureus im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Wir stellten auch fest, dass konventionelle Antibiotika hohe minimale Biofilm eradizierende Konzentration (MBEK) Werte (zwischen 128 und >4096 µg/mL) aufwiesen, wenn sie allein gegen Biofilme untersucht wurden. Die Verabreichung von Phagen mit Antibiotika verbesserte die Antibiotika-Wirksamkeit gegen Mono- und Doppelspezies-Biofilm erheblich, insbesondere nach gestaffelter Exposition, wodurch die MBEK-Werte stark reduziert wurden. Interessanterweise zeigte der Staphylokokken Bakteriophage Sb-1 eine dosisabhängige Reduktion der Exopolysaccharidmatrix, während PYO Bakteriophage keine Wirkung zeigte, was darauf hindeutet, dass einige Phagen das Eindringen von Antibiotika in die tieferen Schichten von Biofilmen verbessern könnten. Diese Arbeit zeigte auch, dass sogar noch niedrigere Sb-1- Phagen-Titer phagenbehandelte Staphylococcus aureus -persistente Zellen abtöten können, wenn metabolisch inaktive Zellen in frischem Medium beimpft wurden und zu einem normal wachsenden Phänotyp zurückkehren. Insgesamt generiert diese Arbeit neue Erkenntnisse zur Verhinderung der Besiedlung von Implantaten und zur Abtötung von auf einer Oberfläche anhaftenden Biofilmbakterien. Zu ihrer klinischen Anwendung sind weitere präklinische und klinische Studien erforderlich