Génomique fonctionnelle des prédispositions génétiques du mélanome uvéal

Uveal melanoma (UM) is a rare tumor, yet it is the most common intraocular malignancy in adults with 500 new cases per year in France. It arises from the malignant transformation of melanocytes of the uvea, composed of the choroid (90% of cases), ciliary body (6%) and iris (4%). UM is a genetically simple tumor characterized by two major somatic driver events: mutually exclusive mutations of GNAQ, GNA11, PLCB4 or CYSLTR2, initiating tumorigenesis by constitutive activation of the Gaq signaling pathway, and a second event through mutually exclusive mutations that define metastatic risk and patient outcome: loss-of-function mutations of BAP1 associated with its bi-allelic inactivation by monosomy 3 (M3) leads to UM with high metastatic risk and poor prognosis, while disomy 3 (D3) is associated with either SF3B1 or EIF1AX mutations and respectively confer intermediate and low metastatic risk. Prognosis is dismal after occurrence of metastasis in 30-50% of cases, almost invariably to the liver, with a median survival of ∼12 months. Strikingly, individuals of European ancestry with light eyes and fair skin are particularly at risk of developing UM, with a relative risk (RR) of up to 20 in populations of European ancestry compared to those of African or Asian ancestries. However, the absence of ultra-violet (UV) mutational signature and stable UM incidence over the past decades rule out a role for pigmentation protecting against UV light to explain this peculiar epidemiology. Besides, familial cases of UM are seen in 1% of UMs, yet germline mutations of BAP1 are the only strongly predisposing genetic risk factor known so far and only explain a fraction of familial cases, suggesting that genetic risk of UM mostly remains unaccounted for.We hypothesized that some susceptibility alleles could predispose populations of European ancestry to UM. We sought to investigate the genetic predisposing factors in UM following two approaches: (i) a candidate-gene approach by targeted-sequencing of MBD4 in a large consecutive cohort of 1,093 UM patients, allowing us to demonstrate that MBD4 is a UM predisposing gene associated with high-risk M3 UM, conferring a RR = 9.2 of developing UM compared to general population; and (ii) a genome-wide association study in UM followed by a functional genomics study to identify common, low-penetrant UM risk alleles. Through this second approach, we confirmed the UM risk region at chromosome (chr) 5 on the TERT/CLPTM1L locus and further identified two pigmentation susceptibility loci, HERC2/OCA2 (ch15) and IRF4 (chr6). Importantly, these two loci were differentially associated with high-risk, M3 and low-risk, D3 UMs respectively, distinguishing two UM subgroups marked by specific genetic risk factors influencing tumor biology and metastatic potential. Lastly, we functionally characterized the TERT/CLPTM1L UM risk locus. After demonstrating an allele-specific regulation of gene expression at this locus, we narrowed down the genomic region to one functional variant, rs452384, which exhibited allele-specific nuclear factor binding properties. Using a quantitative proteomic approach, we evidenced binding of NKX2.4 transcription factor specifically to the rs452384-T allele. We further show that knockdown of NKX2.4 in UM cell lines results in a subtle yet significant increase in TERT and CLPTM1L expression, representing the first steps towards deciphering the tumorigenic mechanism of this risk locus in UM. Finally, we suggest that rs452384 may mediate its activity through differential telomere length regulation, potentially arising prior to UM tumorigenesis. Taken together, these results shed light on multiple moderate and low-risk genetic predisposition factors in UM, which bring new insights on the underlying biological mechanisms in UM predisposition, and has clinical relevance as patients with MBD4 deficiencies may respond to immunotherapy, resulting in the addition of MBD4 to clinical genetics panels.Le mélanome uvéal (MU) est un cancer rare, mais reste la tumeur intraoculaire la plus fréquente chez l’adulte avec 500 nouveaux cas par an en France. Le MU est lié à la transformation maligne des mélanocytes de l’uvée, composée de la choroïde (90% des cas), du corps ciliaire (6%) et de l’iris (4%). Le MU a une faible charge mutationnelle et comporte deux événements oncogéniques majeurs : l’activation constitutive de la voie de signalisation Gaq par mutations activatrices mutuellement exclusives de GNAQ, GNA11, PLCB4 ou CYSLTR2, et une seconde étape dans la transformation maligne, caractérisée elle aussi par des mutations mutuellement exclusives impactant le risque métastatique : les mutations de BAP1 (associées à une inactivation bi-allélique du gène par perte de l’allèle sauvage par monosomie 3, M3) constituent le MU à haut risque métastatique et mauvais pronostic, tandis que les mutations de SF3B1 ou EIF1AX (associées à la disomie 3, D3) confèrent un risque respectif intermédiaire et faible de métastases. Le très mauvais pronostic du MU métastatique, hépatique dans la majorité des cas, se caractérise par une survie médiane de 12 mois. Le MU est associé aux populations européennes, et aux individus à la peau et aux yeux clairs, avec un risque relatif (RR) 10 à 20 fois plus élevé chez les populations de souche européenne qu’africaine ou asiatique. L’absence de signature UV exclue le rôle des différences de pigmentation dans la protection des UV pour expliquer cette épidémiologie remarquable. De même, les mutations germinales de BAP1, seul facteur de risque génétique à forte pénétrance connu, n’expliquent qu’une partie des cas familiaux du MU, suggérant l’existence d’autres facteurs de prédisposition génétique.Nous avons émis l’hypothèse d’allèles à risque prédisposant les populations européennes au MU. Nous avons utilisé deux approches : (i) l’évaluation du gène candidat MBD4 par criblage de mutations dans une cohorte consécutive de 1,093 patients de MU, nous permettant de démontrer que MBD4 prédispose au MU à haut risque métastatique avec un RR de 9 comparé à la population générale ; et (ii) l’identification de polymorphismes fréquents de risque par étude d’association pan-génomique et la caractérisation de leurs conséquences moléculaires par une étude de génomique fonctionnelle. Nous avons ainsi pu démontrer l’implication de régions de risque sur les chromosomes 5, 6 et 14 (loci respectifs TERT/CLPTM1L, IRF4 et HERC2/OCA2). Les deux derniers loci ont un rôle majeur dans la pigmentation ; nous avons pu montrer leur association différentielle avec le MU à haut (M3) et faible (D3) risque métastatique (HERC2/OCA2 et IRF4 respectivement), indiquant deux facteurs de risque distincts ayant un impact sur le potentiel métastatique. Enfin, la caractérisation fonctionnelle du locus TERT/CLPTM1L nous a permis de démontrer la spécificité allélique de la régulation génique à cette région et d’identifier un variant fonctionnel du MU : rs452384. Celui-ci permet la fixation différentielle de facteurs nucléaires, parmi lesquels nous avons identifié par spectrométrie de masse quantitative NKX2.4, facteur de transcription spécifiquement associé à l’allèle T de rs452384. La sous-expression de NKX2.4 dans des modèles cellulaires du MU résulte en l’augmentation légère mais significative de l’expression des gènes TERT et CLPTM1L, constituant la première étape dans l’élucidation des mécanismes biologiques de cette région de risque. Enfin, nous émettons l’hypothèse que rs452384 régule de manière différentielle la longueur des télomères, avant l’apparition de la tumeur. Ces résultats mettent en avant le rôle de facteurs de risque à pénétrance faible ou modérée dans le MU et l’implication potentielle de mécanismes biologiques sous-jacents. Notamment, l’impact clinique du MU dans un contexte d’inactivation de MBD4 est l’inclusion de MBD4 dans les panels oncogénétiques pourraient permettre l’identification de patients répondant à l’immunothérapie