Implementation and improvement of metal-film phase plates for single-particle cryo-EM

Over the past few decades, Single-Particle Analysis (SPA), in combination with cryo-transmission electron microscopy, has evolved into one of the leading technologies for structural analysis of biological macromolecules. It allows the investigation of biological structures in a close to native state at the molecular level. Within the last five years the achievable resolution of SPA surpassed 2°A and is now approaching atomic resolution, which so far has only been possible with Xray crystallography in a far from native environment. One remaining problem of Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) is the weak image contrast. Since the introduction of cryo-EM in the 1980s phase plates have been investigated as a potential tool to overcome these contrast limitations. Until now, technical problems and instrumental deficiencies have made the use of phase plates difficult; an automated workflow, crucial for the acquisition of 1000s of micrographs needed for SPA, was not possible. In this thesis, a new Zernike-type Phase Plate (PP) was developed and investigated. Freestanding metal films were used as a PP material to overcome the ageing and contamination problems of standard carbon-based PPs. Several experiments, evaluating and testing various metals, ended with iridium as the best-suited material. A thorough investigation of the properties of iridium PP followed in the second part of this thesis. One key outcome is a new operation mode, the rocking PP. By using this rocking-mode, fringing artifacts, another obstacle of Zernike PPs, could be solved. In the last part of this work, acquisition and reconstruction of SPA data of apoferritin was performed using the iridium PP in rocking-mode. A special semi-automated workflow for the acquisition of PP data was developed and tested. The recorded PP data was compared to an additional reference dataset without a PP, acquired following a conventional workflow.In den vergangenen Jahrzehnten haben sich Einzelpartikelanalyse (EPA) und Kryotransmissionselektronenmikroskopie(Kryo-EM) zu einer der führenden Technologien für die strukturelle Analyse von biologischen Makromolekülen entwickelt. Dies erlaubt die Untersuchung biologischer Strukturen in einem möglichst naturgetreuen Zustand auf molekularer Ebene. In den letzten fünf Jahren überwand die EPA erstmals die Auflösungsgrenze von 2°A und erreichte somit atomare Auflösung, was bislang nur mittels Röntgenkristallographie möglich war. Ein bestehendes Problem der Kryo-EM ist der schwache Bildkontrast. Seit der Einführung der Kryo-EM in den 1980er Jahren, wurde an Phasenplatten als mögliches Werkzeug, zur Verbesserung des Bildkontrasts geforscht. Hier limitierten immer technische Probleme bei der Herstellung oder geräteseitige Limitierungen, wie z.B. Hysterese der Linsen, den erfolgreichen Einsatz solcher Phasenplatten. Insbesondere ein automatisierter Arbeitsablauf für die Steuerung des Mikroskops und die Aufnahme der Bilder ließ sich nie realisieren. In dieser Doktorarbeit wurde eine neue Zernike-Phasenplatte entwickelt und untersucht. Freistehende Metallfilme dienten als Phasenplattenmaterial, um Alterungsund Kontaminationsprobleme der bislang üblichen kohlenstoffbasierten Phasenplatten zu überwinden. In ersten Experimenten zur Materialwahl wurde Iridium als geeignetes Metall identifiziert. Der zweite Teil der Arbeit behandelt die Untersuchung der Iridium-Phasenplatten hinsichtlich ihrer Eigenschaften und ihrem Verhalten im Elektronenmikroskop. Ein Resultat dieser Experimente ist der sogenannte rocking-Modus, bei dem die Phasenplatte während der Aufnahme bewegt wird und wodurch sich Streuungs- und andere Artefakte, die bei den Zernike-Phasenplatten üblicherweise auftreten, verhindern oder deutlich reduzieren ließen. Die Entwicklung eines angepassten Workflow ermöglichte die Aufnahme von EPADatens ätzen mit Phasenplatte über mehrere Tage. Für die Evaluierung der Phasenplattendaten wurden Datensätze von Apoferritin mit und ohne Phasenplatte aufgenommen und miteinander verglichen