Role of CCBE1 in the contribution of the embryonic epicardium to the coronary vasculature development

Tese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA vasculatura coronária é responsável por fornecer e remover o sangue do músculo cardíaco, sendo o seu correto desenvolvimento essencial para o funcionamento do coração em embriões e adultos. Os defeitos associados ao seu desenvolvimento constituem atualmente uma das principais causas de morte a nível mundial, conhecidos como doenças arteriais coronárias. O epicárdio, a camada epitelial externa que cobre todo o miocárdio, é um dos principais precursores da vasculatura coronária. Durante o seu desenvolvimento ocorre uma transição através da qual células com características epiteliais se transformam em células mesenquimais, denominadas células derivadas do epicárdio. Estas células derivadas do epicárdio migram para o interior do musculo, diferenciando-se e dando origem principalmente a células do músculo liso, pericitos e células endoteliais. Contribuindo assim para a formação morfológica do sistema vascular coronário. Estas células incorporam-se nas camadas íntima, media e adventícia dos vasos sanguíneos coronários em desenvolvimento. Eventualmente, os vasos de todas as origens diferentes acabam por se associar e formar a vasculatura coronária definitiva. O epicárdio não só coopera no desenvolvimento da vasculatura coronária por meio das células derivadas do epicárdio, mas também através de diferentes vias de sinalização celular. Ao mesmo tempo, o epicárdio desenvolve uma relação estreita com o miocárdio, através de uma comunicação retroativa entre o epicárdio e os cardiomiócitos do miocárdio. Tudo isso torna o epicárdio um elemento essencial para o desenvolvimento da vasculatura coronária, pelo que perceber o desenvolvimento do epicárdio e como este afeta a vasculatura coronária é essencial para o tratamento de doenças atuais associadas, abrindo igualmente caminhos para a criação de novas abordagens terapêuticas. Estudos recentes demonstraram que CCBE1, uma proteína conhecida pelo seu papel no desenvolvimento do sistema linfático, também é expressa no epicárdio, e que a perda de função da proteína causa defeitos na vasculatura coronária, nomeadamente um menor número de vasos coronários no miocárdio como um todo. CCBE1 também é conhecida pelo seu papel na maturação do VEGF-C, um conhecido regulador do desenvolvimento do sistema linfático, e também demonstrou ser essencial para a formação da vasculatura coronária subepicardial e do pedúnculo das artérias coronárias. Sabe-se que os mutantes de Ccbe1 apresentam um desenvolvimento incorreto da vasculatura coronária, mas a contribuição direta do epicárdio nestes mutantes ainda é desconhecida. Como tal, propomos estudar o impacto de CCBE1 na participação do epicárdio embrionário e dos seus derivados no desenvolvimento da vasculatura coronária. Para tentarmos desvendar a função de CCBE1 no desenvolvimento coronário, usámos duas linhas de ratinhos mutantes. Uma linha sistémica (Ccbe1tm1lex) onde Ccbe1 é deletado de todas as células do organismo, e outra linha mutante (Nkx2.5cre;Ccbe1fEl1/−), usando uma linha condicional recentemente criada no nosso laboratório, Ccbe1flE1, junto com o Nkx2.5Cre driver, que, após cruzamento, é feita a perda de função de CCBE1 em todos os tecidos Nkx2.5+ , desta forma teremos embriões sem CCBE1 no primeiro e segundo campo do coração e nos seus derivados. Nas experiências realizadas com o mutante sistémico focámos o nosso estudo no epicárdio. Primeiro, avaliámos o fenótipo das células epicardiais e a sua morfologia através de imunofluorescência. Usando Raldh2 um marcador das células epicardiais, observamos que in vivo e in vitro mantém a forma de paralelepípedo que as caracteriza. A seguir, para descrever o fenótipo in vitro usamos os marcadores ZO-1, um marcador de junções celulares nas células epiteliais, e N-caderina, um marcador de células mesenquimais. Observámos que as células dos corações controlos e mutantes tinham um fenótipo epitelial, mas nas células mutantes foi também detetada a expressão de N-caderina. O que nos leva a sugerir que a falta de CCBE1 nos ratinhos mutantes causou a sobrexpressão de N-caderina, tendo assim como resultado um fenótipo híbrido. As capacidades migratórias e proliferativas também foram analisadas, observámos que os mutantes têm um defeito em ambas já que apresentam menores proliferação celular e capacidade de invasão. Contudo, a expressão de N-caderina costuma ser um indicador do início da transição de células epiteliais para mesenquimais, o que deveria levar a um aumento da proliferação e migração das células que apresentam o sinal, o que não se verifica nos nossos mutantes. Por esse motivo, consideramos que o defeito na migração é causado pelo fenótipo híbrido, que faz com que as células migrem em subgrupos, retardando assim a migração. Ainda assim, a baixa taxa de proliferação nos mutantes continua a contrariar a expressão de N-caderina nos mutantes. Tendo em conta estes resultados, propusemos estudar a expressão relativa do RNA em genes envolvidos na transição epitelial-mesenquimal usando como amostra os ventrículos de corações em diferentes estadios de desenvolvimento da vasculatura coronária (E11.5, E12.5 e E14.5). Verificámos a expressão de 4 genes (Meox1, Tbx2, Has2 e BMPER) retirados de uma análise previa através de RNA-seq, onde foram encontrados estes genes diferencialmente subexpressos a E11.5. Comparando estes resultados com os nossos de RT-qPCR, conseguimos observar que embora o padrão de expressão seja semelhante entre analises nos tempos de desenvolvimento estudados, no RT-qPCR verificámos que os genes estão sobrexpressos nos corações mutantes em comparação com os controlos. O que vai ao encontro dos resultados da migração e proliferação, já que estes genes são conhecidos por aumentarem a capacidade proliferativa e migratória para estimular a transição. Contudo, pensamos que isto pode ser causado pelo tipo de amostra usado, pelo que de seguida testamos um novo protocolo para recolher amostras só de células epicardiais. Não obstante, os resultados não foram os esperados. Devido a grande variação observada e a uma reduzida quantidade de amostra genética, não conseguimos detetar nenhuma desregulação na expressão dos genes testados. No entanto, achamos que usando um conjunto de amostras com esta abordagem seria o mais adequado para o estudo da transição nas células epicardiais. Adicionalmente, no mutante condicional recentemente gerado foi realizada a caracterização do desenvolvimento da vasculatura coronária. Para isso, observámos o pedúnculo das artérias coronárias, que se forma através da ligação de uma rede de vasos sanguíneos com a aorta. O pedúnculo costuma estar completamente estabelecido a E13.5. Nos mutantes condicionais observámos que a perda de função de CCBE1 nestes tecidos causa uma perturbação na formação do pedúnculo, onde a E13.5 só um mutante condicional de 5 tinha a haste formada, no entanto, esta era mais baixa do normal. Estes resultados levam-nos acreditar que CCBE1 é necessário para a conexão entre a rede de vasos sanguíneos e a aorta. Finalmente, quisemos observar se o crescimento cardíaco estava a ser afetado pela perda de função de CCBE1 nos tecidos derivados de Nkx2.5. Para aferir se existe algum defeito, medimos o comprimento do miocárdio compacto e trabecular em alguns estádios de desenvolvimento (E12.5, E13.5, E14.5 e E16.5). Os resultados demonstraram que os mutantes condicionais apresentavam uma parede compacta mais delgada e a trabecular mais comprida, quando comparados com os controlos, o que nos leva acreditar que CCBE1 pode ser preciso para a correta compactação e/ou trabeculação do miocardio. Em conclusão, postulamos que CCBE1 contribui para as células do epicárdio através da regulação da proliferação e migração celular e que pode ser necessário para a subregulação de N-caderina, e assim manter o fenótipo epitelial das células. Nas nossas experiências o mutante condicional demonstrou que CCBE1 é critico para a correta compactação e trabeculação do miocárdio. De igual modo, com o novo mutante condicional conseguimos estudar estadios mais avançados de desenvolvimento, o que não nos era possível com o mutante sistémico.Coronary artery disease is one of the most common causes of death globally. Identifying coronary vascular progenitors and their developmental pathways could inspire novel regenerative treatments. Several studies have shown that the epicardium critically contributes to the proper formation of the primitive coronary endothelial plexus through the epicardial derived cells that migrate to the myocardium wall of the developing heart, where the coronary vessels will arise. Recently, Ccbe1 has been described as required for coronary vasculature development in the mouse heart, as the absence of CCBE1 leads to underdeveloped coronary vessels. Accordingly, Ccbe1 expression has been detected in the embryonic epicardium. However, whether the defect in coronary vasculature development of Ccbe1-/- mutant hearts is a consequence of the alteration of epicardial function, such as epicardial cell migration and proliferation due to the lack of CCBE1 remains unstudied. Here, we used two Ccbe1 mutant mouse lines, a systemic-KO (Ccbe1tm1lex) and a conditional-KO (Nkx2.5cre;Ccbe1flE1/−) line. In the conditional line, we used a Nkx2.5Cre driver, which is expressed in the first and second heart fields, to selectively have the loss of function of CCBE1. We show evidence that CCBE1 has an impact on the contribution of the epicardium to coronary development, specifically in the proliferation and migration during the epithelial to mesenchymal transition (EMT). Additionally, using the conditional-KO, we demonstrated that the trabeculation/compaction of the ventricles is impaired in later stages of development and that the lack of function of CCBE1 in the Nkx2.5-derived tissue is necessary for the formation of the coronary artery stem. Finally, the results suggest a disruption in the EMT program. Simultaneously, there is a disruption in the cell division and invasion rate of the epicardial cells in the mutant hearts that could be caused for the hybrid phenotype observed in the cells, resulting for the lack of CCBE1