Microglía e hipoxia: implicaciones en la enfermedad de Alzheimer

Introducción La microglía es un tipo de célula de soporte neuronal (neuroglía) presente en el sistema nervioso central de vertebrados e invertebrados cuya función principal es actuar como célula inmune. Como su nombre sugiere se trata de células de pequeño tamaño, las más pequeñas de toda la neuroglía. Durante muchos años su función no estuvo clara, sin embargo hoy en día se sabe que estas células median la respuesta inmune en el sistema nervioso central actuando como macrófagos, limpiando de restos celulares y neuronas muertas el tejido nervioso a través del proceso de fagocitosis. El origen embriónico de estas células es distinto del resto de neurogliales. Mientras que las demás derivan del neuroectodermo, que da lugar al tejido nervioso, la microglía deriva durante la embriogénesis de macrófagos del saco vitelino, los cuales migran al neuroepitelio y dan lugar al sistema inmune en el cerebro adulto (Ginhoux, Greter et al. 2010). En organismos maduros también pueden ser generadas por los monocitos que circulan por el torrente sanguíneo y que se dirigen al sistema nervioso central. La microglía es activada por la inflamación del sistema nervioso central, que a su vez puede producirse como consecuencia de enfermedades neurodegenerativas, como es el caso de la enfermedad de Alzheimer (AD) o por enfermedades infecciosas como el síndrome de Creutzfeldt-Jakob. La respuesta de este tipo de células puede verse influenciada por el ambiente en el que se encuentren, por lo que dicha respuesta dependerá de la capacidad que tengan para adaptarse a esos cambios. La enfermedad de Alzheimer es una de las enfermedades neurodegenerativas más comunes y la forma más común de demencia, afectando al 6% de personas mayores de 65 años, aumentando su tasa de aparición con la edad, llegando al 50% en los mayores de 85 años (Thies and Bleiler 2011). Las principales características patológicas de esta enfermedad son la aparición de las llamadas placas amiloideas en el parénquima cerebral, así como la formación y acumulación de los llamados ovillos neurofibrilares. Ambas características son usadas en el diagnóstico de la enfermedad y aunque fueron descritas por Alois Alzheimer hace ya más de 100 años, el conocimiento de su formación y consecuencias es mucho más reciente y sigue siendo objeto de controversia. Los mecanismos moleculares que subyacen la patogénesis de la mayoría de casos de Alzheimer esporádico se desconocen. Por largo tiempo se ha aceptado que el progreso de la enfermedad de Alzheimer conduce a un descenso concomitante en la disponibilidad de oxígeno en el cerebro. La principal hipótesis para explicar la hipoxia cerebral en AD está asociada con la deposición de Aß en la microvasculatura (angiopatía amiloidea) y la afectación del Locus coeruleus, una región cerebral que controla el riego sanguíneo en el cerebro. Existen estudios en humanos que relacionan bajos niveles de oxígeno en el cerebro como un posible causante del comienzo temprano de la enfermedad de Alzheimer (Zetterberg, Mortberg et al. 2011). Antecedentes La hipoxia es un estado fisiológico caracterizado por una bajada en la concentración de oxígeno en el tejido. Esta puede generarse por multitud de causas, como el infarto de miocardio, los accidentes cerebro-vasculares o el cáncer. Entre los principales factores que controlan la respuesta de las células a hipoxia está el factor HIF1¿, factor expresado de forma constitutiva pero degradado por el sistema ubiquitina-proteosoma tras su marcaje unas enzimas denominadas prolil-hidroxilasas (PHDs). Dicho marcaje y degradación es dependiente de la presencia de oxígeno por lo que al producirse una bajada en la concentración de éste, HIF1¿ se dirige al núcleo donde activará la transcripción de multitud de genes que garanticen la adaptación al ambiente hipóxico (Semenza 2012). Numerosas publicaciones han demostrado que las células derivadas de línea mieloide presentan ciertas diferencias en su respuesta a hipoxia si comparamos con el resto de tipos celulares. En el caso de los monocitos, precursores de macrófagos y microglía, se ha observado que no estabilizan el factor HIF1¿, por lo que deben poseer otros mecanismo de adaptación que garanticen la respuesta (Elbarghati, Murdoch et al. 2008; Fangradt, Hahne et al. 2012). En el caso de neutrófilos se ha observado que la hipoxia afecta a su capacidad de supervivencia, y por tanto a la respuesta inflamatoria (Mecklenburgh, Walmsley et al. 2002). En el caso de macrófagos artículos demuestran que la hipoxia disminuye la capacidad migratoria y quimiotáctica de éstos (Turner, Scotton et al. 1999; Grimshaw and Balkwill 2001). Ante el hecho de que en paralelo al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer se genere un ambiente hipóxico en el cerebro, la capacidad de adaptación de la microglía a la hipoxia determinará su capacidad de respuesta a la enfermedad. Hipótesis Con el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer se genera un ambiente hipóxico en el cerebro. Dicho ambiente provocará cambios en la capacidad de respuesta de la microglía, y por tanto en el desarrollo de la enfermedad. Objetivos ¿ Estudiar los cambios fenotípicos que produzca la hipoxia sobre la microglía. ¿ Estudiar los mecanismos moleculares que subyacen a estos cambios. ¿ En el caso de que la hipoxia tenga un efecto sobre la microglía, analizar como afectan estos al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. Resultados y discusión La hipoxia produce un descenso de la densidad de la microglía así como una depopulación de las placas de Aß en un modelo de EA En esta tesis se muestra que animales con EA expuestos a hipoxia crónica presentan una alteración específica de la de la microglía, en su densidad total y más concretamente alrededor de las placas seniles, que no se observa en astrocitos. Este último descenso se da tanto en el número de células rodeando las placas de Aß como en la superficie de placa ocupada por proyecciones de microglía. La pérdida de la microglía alrededor de las placas podría dar lugar a un aumento de la extensión de la patología de Aß a través del parénquima cerebral adyacente. Para analizar si la afectación de la microglía tiene un efecto sobre la enfermedad se estimaron los oligómeros solubles de Aß fibrilar, observando un incremento en las fracciones de hipocampo extraídas de animales hipóxicos, lo que sugiere una reducción en la función de barrera de la microglía. Sin embargo, no puede aseverarse que el aumento de dichos oligómeros fibrilares se deba a un incremento de la liberación a partir de las placas, y que a su vez esto sea consecuencia de la ausencia de microglía. En este sentido, el análisis de los oligómeros solubles totales mediante el uso de anticuerpos específicos no mostró un incremento de estos en los animales hipóxicos. El hecho de que sólo aumenten los niveles de Aß fibrilar y no de otros oligómeros solubles podría deberse a un efecto de la hipoxia sobre la oligomerización del Aß, su solubilidad o sobre la capacidad fagocítica de la microglía. La hipoxia provoca una reducción de la proliferación y de la quimiotaxis de la microglía El análisis realizado tanto en líneas celulares como cultivos primarios de microglía reveló una clara caída en la proliferación en condiciones de hipoxia, que mostró ser reversible y que puede reproducirse en normoxia mediante la adición del inhibidor de las prolil-hidroxilasas DMOG, sugiriendo la implicación de HIF o de las PHDs en su regulación. Así mismo, el análisis inmunohistoquímico de los cerebros de los ratones con EA avanzada reveló una clara reducción de la proliferación microglíal en los expuestos a hipoxia. Las células mieloides deben llevar a cabo su acción defensiva en ambientes hipóxicos donde combaten la infección, facilitan la inflamación, estimulan la inmunidad adaptativa o participan en funciones de reparación de tejidos (Lewis, Lee et al. 1999). Por otro lado, estas células están altamente adaptadas a la hipoxia debido a su metabolismo glicolítico y a un programa genético que les permite sobrevivir a bajos niveles de oxígeno (Cramer, Yamanishi et al. 2003; Murdoch and Lewis 2005; Walmsley, Print et al. 2005; Bosco, Puppo et al. 2008). Está bien descrito que los monocitos son atraídos a tejidos hipóxicos donde se diferencian a macrófagos. En este proceso, monocitos y macrófagos regulan genes relacionados con la migración y quedan atrapados en dichos ambientes hipóxicos (Turner, Scotton et al. 1999; Bosco, Puppo et al. 2008). A pesar de la importancia de la hipoxia en la progresión de la enfermedad de Alzheimer, ningún estudio previo analiza en control de la quimiotaxis de la microglía por la hipoxia. Los resultados presentados en esta tesis muestran un claro descenso en la quimiotaxis de la microglía hacia el Aß y el ATP al exponerla a condiciones de hipoxia, tanto en una línea celular como en cultivo primario. Este fenómeno también se reprodujo en normoxia en presencia de DMOG, lo que sugiere un papel de HIF o de las PHDs en la inhibición observada en hipoxia de la quimiotaxis, al igual que se observó en la proliferación. No se pudo analizar, sin embargo, el efecto de la hipoxia sobre la capacidad migratoria o quimiotáctica de la microglía in vivo, al realizarse dicha exposición dentro de una cámara sin un sistema de imagen acoplado. Se ha descrito que la microglía activa alrededor o asociada a las placas muere por apoptosis (Lassmann, Bancher et al. 1995; Yang, Sun et al. 1998). Bajo circunstancias no patogénicas, la microglía residente se mantendrá en su lugar y se preparará para realizar su función inmune normal. En los cerebros con EA, en condiciones normales, la microglía del parénquima adyacente prolifera y migra hacia las placas de Aß y recupera la barrera. Sin embargo, es posible especular que en cerebros que sufran hipoxia y Alzheimer, la muerte celular de la microglía alrededor de las placas en combinación con la reducción de la capacidad quimiotáctica y de la tasa proliferativa, de lugar a una despoblación o ausencia de estas células alrededor de las placas seniles. La clara reducción de la densidad microglial en el cerebro completo y en particular de la asociada a las placas de Aß en sólo 20 días de hipoxia podría ser indicativo de la existencia un proceso dinámico alrededor de estas. Para apoyar esta hipótesis, un estudio reciente ha demostrado que la microglía tiene una alta capacidad proliferativa, así como la existencia de precursores en el cerebro capaces de repoblarlo de manera completa en menos de una semana (Elmore, Najafi et al. 2014). Además, se ha descrito la existencia de marcadores mitóticos alrededor de placa en modelos de Alzheimer (Kamphuis, Mamber et al. 2012; Kamphuis, Orre et al. 2012). Sin embargo, la capacidad proliferativa de la microglía en los pacientes de Alzheimer se ha puesto en duda en un estudio reciente (Serrano-Pozo, Gomez-Isla et al. 2013). Por tanto, es necesario llevar a cabo análisis más profundos para extender las observaciones encontradas a modelos animales y a la enfermedad en humanos. La hipoxia sostenida no modifica el metabolismo de Aß Diversos estudios han sugerido la modulación del procesamiento de Aß por hipoxia. No obstante, estos estudios in vivo se basaron en la exposición de los animales a ciclos de hipoxia reperfusión (Sun, He et al. 2006; Li, Hong et al. 2009) y aunque estos modelos eran interesantes, no se asemejan a patologías humanas que cursan con hipoxia sostenida, como la enfermedad obstructiva pulmonar crónica (COPD), enfermedades cardiovasculares, o situaciones en las que el flujo sanguíneo cerebral se reduce. Algunas de estas patologías humanas se han sugerido como importantes contribuidoras en la demencia en la enfermedad de Alzheimer (Dotti and De Strooper 2009). Es por esto que un modelo de hipoxia sostenida podría ser muy relevante de cara a clarificar si la hipoxia tiene un efecto sobre la regulación de la producción o degradación del péptido Aß. Los resultados presentados en esta tesis muestran que la reducción de los niveles de oxígeno no produce cambios en la expresión de los principales genes codificantes para enzimas involucradas en el metabolismo del Aß. El descenso de los niveles de oxígeno tampoco tuvo un efecto en los niveles y carga total del péptido Aß y del APP¿ soluble en los cerebros del modelo de enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, el análisis de los cerebros de los ratones APP/PS1 hipóxicos si mostró cambios en la distribución de placas en la corteza, observándose un aumento del número de placas de pequeño tamaño, lo que podría ser indicativo de un aumento de placas de novo. Que este incremento esté relacionado de manera directa con el incremento de Aß fibrilar observado en la fracción soluble o con el descenso de la población microglial requiere de un estudio en más profundidad. La hipoxia acelera la patología de Alzheimer Como se indicaba previamente, en los animales hipóxicos se observó un aumento del Aß fibrilar en la fracción soluble. En este sentido, se ha descrito una relación entre el aumento de Aß fibrilar soluble, la patología tau y la afectación cognitiva (Chabrier, Blurton-Jones et al. 2012), por lo que se analizó el daño neuronal en estos ratones, observando un aumento del número de neuritas distróficas alrededor de placa en corteza mediante marcaje P-Tau, así como del contenido en ubiquitina en el cerebro de los ratones expuestos a hipoxia, ambos marcadores de daño neuronal. Sin embargo, no se observaron diferencias en el número de neuritas distróficas alrededor de placa en el hipocampo, probablemente debido al hecho de que la patología Tau se encuentra muy avanzada a esta edad en el hipocampo de los animales usados para este estudio, así como tampoco se observó un descenso del número de neuronas. Sí se observó en cambio un descenso en los niveles de mRNA de Somatostatina y Neuropéptido Y, marcadores de dos poblaciones neuronales descritas como las primeras poblaciones afectadas en fases tardías de la neurodegeneración en este modelo animal (Ramos, Baglietto-Vargas et al. 2006). Acumulación de HIF1¿ en cerebros de pacientes de Alzheimer En estudios previos se ha mostrado que la progresión de la enfermedad de Alzheimer da lugar a una reducción de los niveles de HIF1¿ y de sus dianas GLUT1 y GLUT3 (Liu, Liu et al. 2008). Sin embargo, el análisis de las muestras de pacientes mostró la acumulación de HIF1¿ en los estadíos iniciales de la enfermedad seguida de una caída repentina en los estadios V/VI. La razón principal para esta discrepancia podría ser la estratificación de los pacientes usada para cada estudio. Liu y colaboradores usaron muestras de pacientes en estados II/III como grupos control mientras que en el análisis realizado en esta tesis se presentan muestras estratificadas incluyendo de forma separada los grupos de estado II y III/IV, y usando como referencia para el análisis controles jóvenes. Otra diferencia entre ambos estudios es la región del cerebro analizada, mientras que Liu y colaboradores utilizaron la corteza, en esta tesis se utiliza el hipocampo. En este sentido, un estudio recientemente publicado coincide con los resultados presentados, aunque con un número menor de pacientes analizados. En dicha publicación los autores muestran que VEGF muestra un perfil de expresión similar en el cerebro de pacientes de Alzheimer al que se muestra aquí para HIF1¿ (Tang, Mao et al. 2013). Por otra parte, la acumulación de HIF1¿ no se encuentra regulada sólo por la hipoxia, sino también por estímulos inflamatorios. El hecho de que se observe una caída de HIF1¿ o de sus dianas (VEGF) en los grupos que se corresponden con estados avanzados de la enfermedad y por tanto de mayor estado inflamatorio (estados V/VI) sugiere de manera robusta que la expresión de HIF1¿ es neuronal y que la muerte celular asociada a estos estados podría dar lugar o tener un efecto sobre la reducción observada. El hecho de que en el cerebro de pacientes de la enfermedad de Alzheimer junto al proceso inflamatorio asociado a la patología se desarrolle un ambiente hipóxico, tal como sugiere el análisis de los niveles de HIF1¿ presentado, permite plantear que los resultados obtenidos y el modelo propuesto para el animal APP/PS1 podrían ser interesantes en el conocimiento de la patología humana. De este modo, podrían explicarse la comorbilidad observada entre patologías vasculares y enfermedad de Alzheimer en los estudios epidemiológicos realizados en pacientes con demencia, así como el mayor riesgo de desarrollar la EA en personas con problemas vasculares