Étude de l'interaction fonctionnelle du récepteur NTS2 avec la sécrétogranine III

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) font partie de la plus importante famille de récepteurs membranaires. Leur implication dans une grande majorité de processus physiologiques et pathologiques en fait une cible pharmaceutique de choix. Parmi les RCPG, nous avons déjà démontré que le récepteur de la neurotensine NTS2 joue un rôle important dans la régulation de la transmission de l'information nociceptive. Cependant, des études ont révélé que le récepteur NTS2 est principalement localisé dans des compartiments intracellulaires et est notamment stocké dans l'appareil de Golgi. Par conséquent, les processus de transport et de trafic du récepteur vers la membrane plasmique sont critiques pour son activation par des agonistes exogènes. Dans le but d'étudier les mécanismes qui conduisent à l’insertion du récepteur NTS2 à la surface cellulaire, nous avons procédé à un criblage en double hybride chez la levure pour identifier des protéines potentiellement impliquées dans la régulation du trafic de NTS2. Nous avons utilisé le fragment correspondant à la troisième boucle intracellulaire du récepteur NTS2 comme appât pour cribler une banque d'ADNc de cerveau de rat. Cet essai a permis d'identifier la sécrétogranine III (SCG3), une protéine de la voie de sécrétion régulée, comme partenaire d'interaction du récepteur NTS2. Pour mieux caractériser cette association, les protéines taguées HA-NTS2 et YFP-SCG3 ont été co-exprimées dans les cellules HEK-293 et immunoprécipitées. L'analyse par immunobuvardage de type Western a révélé la présence de bandes à 45 et 80 KDa, correspondant au récepteur HA-NTS2 et à la protéine YFP-SCG3 respectivement, démontrant l'interaction par la co-immunoprécipitation des protéines. Des études de microscopie confocale effectuées sur des cellules HEK-293 coexprimant CFP-NTS2 et YFP-SCG3, ont également montré que les deux protéines colocalisent à l’échelle subcellulaire. Des analyses de transfert d'énergie entre molécules fluorescentes (frT) ont été réalisées afin de confirmer l'interaction moléculaire NTS2-SCG3. Enfin, dans le but de déterminer l'impact physiologique de la régulation de l'adressage à la membrane plasmique du récepteur NTS2 par la SCG3, nous avons développé deux DsiRNA afin de réduire l'expression de SCG3. Ces DsiRNA dirigés contre SCG3 validés in vitro seront prochainement utilisés in vivo chez le rat adulte afin d'examiner leurs effets sur le rôle du récepteur NTS2 dans le contrôle de la douleur. Ainsi, nos résultats suggèrent que la SCG3 pourrait servir de protéine escorte pour NTS2 dans son adressage vers la membrane plasmique. Aussi, nos résultats renforcent l'idée que les RCPG ne sont pas seulement adressés à la surface cellulaire par la voie constitutive mais qu'ils peuvent être transportés via la voie de sécrétion régulée. Finalement, ces résultats suggèrent que l'interaction physique entre NTS2 et SCG3 pourrait affecter la fonction physiologique du récepteur NTS2, y compris son rôle dans le contrôle de la douleur